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牛坏死杆菌外膜囊泡免疫保护作用的研究

摘要：由革兰氏阴性细菌分泌产生的外膜囊泡 ，包含多种生物分子，具有重要的免疫学功能[1]。本实验研究牛坏死杆菌外膜囊泡的免疫保护作用，选取小鼠为实验动物，并将其分为四组，分别为外膜囊泡(OMV)组、牛坏死杆菌43kDa外膜蛋白（43K OMP）组、坏死杆菌灭活组以及对照组，通过进行间接ELISA、小鼠肝细胞细菌载量等实验，可观察到OMV组的小鼠抗坏死杆菌的能力更强，小鼠存活率更高，小鼠肝细胞细菌载量更低，小鼠接种外膜囊泡后抗坏死杆菌免疫力增强。此实验有助于未来基于OMV的疫苗开发，将促进OMV生物工程在生物技术和生物医学中的应用。

关键词：外膜囊泡；坏死杆菌；免疫效果

 

目录

前言 1

1材料与方法 2

1.1实验材料 2

1.1.1实验动物 2

1.1.2实验菌株 2

1.2实验方法 2

1.2.1免疫小鼠 2

1.2.2血清收集 3

1.2.3 小鼠攻菌 3

1.2.4 肝脏细菌载量 3

1.2.5  ELISA检测小鼠抗体效价 3

1.2.5.1 所需试剂配制 3

1.2.5.2 试验步骤 4

2结果 4

2.1 抗体效价检测 4

2.2小鼠存活率结果 5

2.3小鼠肝脏细菌载量检测 5

3讨论 6

4结果 6

 

前言

坏死梭杆菌 (Fusobacterium necrophorum, Fn) 是一种严格厌氧的革兰阴性多形态杆菌, 在新鲜病灶和幼龄培养物中多呈长丝状, 在固体培养基和老龄培养物中多为球状或短杆状。 白细胞毒素被认为是坏死梭杆菌的主要毒力因子。坏死梭杆菌广泛存在于动物和人的口腔、胃肠道和泌尿生殖道中, 经常引起动物的坏死性病变, 是肝脓肿、腐蹄病、坏死性喉炎 (犊牛白喉) 和牛其他坏死性疾病的主要病原菌。根据不同来源的坏死梭杆菌在固体培养基上的菌落形态差异, 将其分为4种亚型, 即A型、B型、AB型和C型。其中, C型坏死梭杆菌没有致病性，AB型坏死梭杆菌同时具有A型和B型坏死梭杆菌的生物学特性;A型坏死梭杆菌常见于牛、羊、鹿等动物的腐蹄病和肝脓肿病灶, 具有血凝活性和溶血活性；B型坏死梭杆菌常见于反刍动物瘤胃内容物和人的急性咽炎综合征, 血凝活性较弱，Shinjo等人比较了该菌的形态学特征和生化特性, 结合细菌基因组GC含量和同源性, 将A型和B型坏死梭杆菌重新命名为Fnn亚种和Fnf亚种。对于这种人畜共患细菌，最好的治疗方法还是疫苗。有数据表明，1957 年至 2015 年，我国共批准 103 种兽用细菌疫苗（李伟杰等，2015），其包括常规的家畜家禽用疫苗，但是对于大家畜、特种动物等应用的疫苗相对缺乏，因此，坏死梭杆菌疫苗的应用前景十分广阔[2]。

对于坏死杆菌的危害性，人们很早就对其有了深刻的认识并对其采取了多种预防措施和应急准备，但由于临床应用上很多问题的出现，包括细菌的耐药性越来越强、抗生素滥用及其残留、灭活疫苗的副作用显著等，使得坏死杆菌的预防效果并不理想，多方面原因迫使人们急需高效、制作简单、副作用低和安全的新型的预防坏死杆菌的方法，而目前关于坏死杆菌疫苗的研究主要集中在亚单位疫苗的研制中，因为这种疫苗具备副作用低，制备简单等优点[3]。

外膜囊泡( outer membrane vesicles，OMV) ，是革兰氏阴性菌在生长阶段分泌的产物，是细菌外膜以出芽的方式释放并在表面形成的一种囊泡状的特殊结构，包括DNA、RNA、毒力因子、周质蛋白、病原相关分子模式(PAMPs)等结构成分和其他外膜成分，例如生物活性蛋白、脂质、代谢物等，因为常常是由细菌外模分泌，所以将这种膜结构的囊泡称为外膜囊泡[4]。OMV的大小为纳米级、形状为球形。几乎所有的革兰氏阴性细菌均能产生外膜囊泡，但很少数的革兰氏阳性菌和古细菌也会产生外膜囊泡[5]。OMV的释放对细菌的存活至关重要，原因就是OMV可去除细菌细胞内不必要的物质，同时也是细菌抵御外界应激刺激的方式之一[6-7]，许多研究阐明不同来源的OMV通过许多不同的方式激活宿主的免疫系统。由于OMVs包含主要的外膜结构以及周质蛋白，作为无生命非复制性疫苗具有一定安全性，且含多种抗原和活性物质，不仅是致病性病原菌的毒力因子之一，而且具良好的免疫原性,所以它们能够作为未来新型良好的疫苗候选[8-9]

与传统疫苗类似, 在脑膜炎球菌的A型和W型的OMV疫苗中加入氢氧化铝佐剂, 可以提高其免疫效果并减少使用疫苗的量[10]。

参考文献

1冯文艳, 张扣兴. 革兰阴性菌外膜囊泡的研究进展[J]. 中国抗生素杂志, 2019, 44(01): 32-39

2孟祥玉 坏死杆菌亚单位疫苗的研制与应用[D] 中国农业科学院 2018

3蒋剑成 牛坏死杆菌43 kDa OMP、PL-4、H2对小鼠免疫效果的评价[D] 黑龙江八一农垦大学 2019

4程谦 吴疆 王岱 细菌外膜囊泡与抗生素相关的研究进展[J].中国抗生素杂志 2019,（10）:1119-1124

3徐锦凤 布鲁氏菌外膜囊泡（OMVs）的制备及免疫原性的评价【D】石河子大学 2018

5陈桥桥 涂仕娟 夏修文.等 细菌外膜囊泡发生机制及其影响因素的研究进展【J】 2019（05） 572-574

6 Carmen Schwechheimer，Meta J. Kuehn. Synthetic Effect between Envelope Stress and Lack of Outer Membrane Vesicle Production in Escherichia coli［J］. Journal of Bacteriology，2013，195( 18) :

4161-4173. 

7 Mcbroom A J，Kuehn M J. Ｒelease of outer membrane vesicles by Gram-negative bacteria is a novel envelope stress response［M］. Molecular Microbiology，2007，63( 2) : 545-558

[8]易洁 刘青 孔庆科 革兰氏阴性菌外膜囊泡作为亚单位疫苗的研究进展J 微生物学报 2016,56（06）911-912

[9]梅晨 孙爱华 李淑芬 副鸡禽杆菌外膜囊泡提取及其成分分析[J] 动物医学进展 2019（11）44-49

赵光夫 雷桂花 彭远义 细菌外膜囊泡合成机制、功能及应用研究进展[J] 中国预防兽医学报2018（08）761-765