苏ICP备112451047180号-6
水黄皮——一种潜在生物燃料作物籽油的理化特性与抗菌活性
摘 要
本研究对水黄皮优良种种籽籽油进行了理化特性与抗菌活性分析。用正已烷抽提的种籽有最高的出油率，可达33%，籽油的理化特性确立了其作为潜在生物燃料作物的可行性；通过气相色谱-质谱联谱分析发现：其单不饱和脂肪酸总量（油酸46%）要高于多不饱和脂肪酸总量（33%）。对用于检测的真菌与细菌培养物，籽油也同时显示了其抑菌作用，即使该抗菌活性在四个浓度梯度（50%，80%，90%和100%）下有浓度依赖性。研究结果进一步证实了具有优良种优良特征水黄皮的籽油可用作柴油与药物。
关键词：抗菌活性，生物柴油，CPT，水黄皮，籽油
1 简介
油产量高的作物对于经济增长的能量和农业部门是非常重要的。籽油的多不饱和脂肪酸是生物柴油[1，2]的重要来源。这些有机籽油在物理化学特性和生物降解性方面比柴油燃料好。[3]这种植物就是直属豆科植物类的水黄皮。
水黄皮又称印度毛鱼藤，是一种生长在印度和缅甸的土地肥沃的沿海岸和河堤单型种属。这种树因它广泛的用途和作为一种潜在的生物柴油来源植物而闻名[4]。有报道称这种树称含油量平均大约28-34%，并且多不饱和脂肪酸的含量比例高[1]。回顾历史，水黄皮一直被用作民间的药用植物，尤其是印度医学中的韦达养生学和悉达打坐系统[5]。这种植物的所有部分早已被用来作为治疗肿瘤、痔疮、皮肤病、瘙痒、脓肿、风湿关节痛、腹泻、溃疡等的药材。[5，6]除此之外，水黄皮在动物饲料、绿色肥料、木材和鱼的毒药中的应用也是很有名。水黄皮在农业和生态环境中操纵﹙的﹚杀虫和杀线虫活跃性也是被公认的。近期，一个生物药的原始资料历史记录说，确切的说明了作为抗菌和治疗药物的水黄皮的效力。
然而，要使用这个物种进行生物柴油的一个原料和生物医学领域更多研究，是有必需的。增加生物柴油的生产重要的是要有一种优质的基因型，即能结出油量能的水黄皮的种子。这种选出来的基因型加上树体（CPT）就是一颗比其他基因型具有优越形态特征的个体树（树的直径，树的高度，重叶子的数量，蓓蕾的数量，花朵的数量，种子的数量）[8]。我们先前在整个水黄皮研究体系中的表征和籽油分析，使我们对标签的优质基因型在北瓦天然生物种群发现计划在内的基因改良的物种[8]。虽然曾经个别地报导这种植物的籽油的化学成分和生物测定[9-11]，但目前还没有系统的研究或者有关研究成果去描述这种优质基因型籽油的组成和它的作为致病的指数的微生物效力的有效攻击范围。
在当前的研究报告中报告在北瓦，阿萨姆，印度发现水黄皮天然种群的稳定的基因型CPT（下文参考原始标签号码为NGPP46）鉴定是基于这种籽油的成分和连续两个形态学性状季节（消除季节性误差或地方误差的可能性）是下一步研究进行的发展目标：
①使用不同的溶剂和利用不同的恒沸溶液对这种种子进行提取这种基因型籽油和籽油产量定量化
②利用正乙烷和乙酸乙酯的分数来分析并比较这种基因型籽油的理化性质
③由出产比例分数最大油来确定这种基因型籽油的脂肪酸组成
④通过这种籽油的抗已标记的真菌和细菌菌株的试验进行探讨这种基因型籽油的抗菌活性。
2 材料和方法
2.1 植物材料
在目前现有的研究使用2007年四月到五月期间在尸罗森林山脉，北瓦（26°14’6”N，91°41’28”E），阿萨姆邦的水黄皮（NGPP46）的CPT个体特征的水黄皮的健康和完全成熟的种子。这种水黄皮优质基因型的特点有优势的属性，即拥有用作转成生产具有理想质量高量最大油量的种子的树体[8]。 把大约1Kg的NGPP46种子放到65℃的烘箱中烘大概5-7天，直到干重不变，然后对其研磨粉碎，在4℃下储存备用（最久可以保存3-6个月），并作为下面的实验材料。
2.2 提取油脂
按照索AOAC（美国石油化学学会）的氏提取法标准的程序[12]称取100g上面已经制备好的干种子粉末，使用不同的溶液（正已烷、石油醚、乙酸乙酯、异丙醇）的沸点。利用恒沸溶液（乙酸乙酯（91.53%）+水（8.47%），异丙醇（87.8%）+水（12.2%））沸点，提取种子粉末中的油脂。提取的油脂时，沸腾物在减压蒸馏下受到单一的升华与蒸发，可以把溶剂全部提取出来，油脂随溶剂被蒸馏出来，最后得到油脂。油脂的含量用干种子的重量的百分比表示。提取出来的油脂在4℃下最久可以储存一个月备用，并作为下面进行公演分析和生物活性研究的实验材料。
2.3 籽油物理性质的测定
正已烷提取出来的水黄皮籽油基本的物理、化学和燃料的相关性质，根据美国ASTMT和AOAC标准实验程序，进行试验。其分子数、颜色、气味、折射指数、密度、酸值、浊点、倾点、运动黏度、热值、以及燃点[12，13]，以十六烷值为根据进行计算，可以确定上面提到的物理性质参数。
2.4 气相色谱-质谱分析
取部分正已烷相通用气相色谱-质谱分析仪器进行分析。把1μl上面实验提取出来的正已烷注入在分裂式的CBP-5模式融合的二氧化硅毛细管柱（含5%苯基甲基聚乙烯硅氧烷，规格30米长*0.25毫米直径 *0.25毫米厚度）里，将毛细管放到设定初始温度为60℃，最终温度为260℃的250℃的检测室里（每分钟增加5℃），当超过平衡时间1.01分钟，氦载气压力为100KPa，流速为50ml/min，界面温度为300℃时，抽样3min。以微软图书馆中威利139.LIB鉴定程序为试验标准对脂肪酸进行鉴定。
2.5 抗菌和抗真菌检测
细菌培养，即在富营养的琼脂培养基里（偏4-5℃下储存）培养的单核细胞增多性李斯特杆菌、大肠杆菌（MTCC108），小肠结肠炎耶尔森氏菌（MTCC859）、副伤寒沙门氏菌，再接种到10ml的营养肉汤中，在37℃培养一个晚上。取一支培养好的肉汤培养基，吸取1ml培养过的营养肉汤到9ml的营养肉汤中(Hi-media)培养48h后通过离心分离提取细胞物质（在2795的转速下离心5min），再用生理盐水进行洗涤不溶的悬浮物。另外取100μl的培养液均匀的涂抹在已经凝固的琼脂平板上，并利用菌落在培养基中扩散方法进行这种分析试验，24小时后观测生长抑制区并记录结果。
真菌斜面培养法，即在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中培养黑曲霉、土曲霉、白色念珠菌。再从不同真菌菌株的孢子悬浮培养体中各取培养液（300μl，106 ml孢子），并均匀涂抹在凝固的察氏琼脂培养基（CDA）平板上。培养48h之后观察并用相同的方式去描述细菌培养物情况，并且记录结果。氨苄西林（USB的50ml/ml试剂盒）还有甲恶唑（100μg/盘的Hi-media）作积极有效控制药物，以去除圆盘直径区（6mm）后用直径区来描述抑制作用的结果（mm）±SD。依据培养结果得出由正已烷提取出来的水黄皮（NGPP46）籽油的最小抑菌浓度（MIC）[14]。用纯二甲基亚砜（DMSO）中稀释籽油，并稀释成不同浓度的（35%-100%），记录最低抑菌浓度（MIC）。细菌和真菌培养物分别涂抹在琼脂平板24-48h之后，根据培养情况提供的检测样品抑制微生物的有形增长情况，得出最低的稀释度。
2.6 统计分析
每个化验样品，都进行了三次检测，用SPSS16.0单因素方差分析软件（ANOVA）分析了这些数据表明前面文献提供的平均值和标准都是成实验结果一不致的。通过LSD测试法来测试了方法之间的差异，并都认为是显著水平在p < 0.05下差异水平有显著性。
3 结果与讨论
3.1 植物材料
要使水黄皮成为一种有效、经济和潜在的生物柴油植物，应具备有生物柴油等特性具有十分重要的意义，比如能高产含油量高及油品质好的种子。这种选出来的基因型加上树体就是一棵比其他基因型具有优越形态特征的水黄皮个体树。在北瓦，阿萨姆天然群体生长的50棵标记的树（每棵树的基因型都不一样），根据对多个营养生长和生殖生长标记，鉴定了十CPT属于两个不同的种群（6和10）。从对于油产量最重要的两个方面即小花数和荚果种子性状分析了这十种CPT，对在第二阶段中长得最好的进行鉴定基因型[8]。最好的CPT报告 (下文参考原始标签号码为NGPP46，图1)为下面试验进一步确定其物理和化学成分与燃料有关的性质，以及测定籽油的生物致病指数。
3.2 油脂提取及含量
这种优质基因型水黄皮的优越属性特征就是它们能高产含油量高的种子。因此，下一个重要步骤就是为从种子或籽核中获得最大油量来制备生物柴油，必须使用正确的提取油脂技术。如表1所示，采用不同的溶剂使用索氏提取法提取籽油产量在26.0%-33.0%范围之间。提取出来的油脂颜色黑暗并有一股难闻的气味。使用正已烷作溶剂用索氏提取法的提取到的最大油量接近33%。使用有机溶剂的优点是溶剂能回收重复使用，回收溶剂过程容易，这方便实施和逐渐广泛应用于许多潜在的生物柴油植物[15]。
对于所有的提取，种子与溶剂一般所用的比例为1:6（体积比），并发现这个比例是在更短的时间内获得更高产量具有优质质量的油脂的最好比例[8]。 然而，研究发现，最少的时间是使用非极性溶剂提取（正已烷和石油醚）。而在极性溶剂的（乙酸乙酯和异丙醇）恒沸溶液，所用的提取时间是用非极性提取等量籽油时间的两倍多。把水当作提取溶剂，使用热水浴提取的方法（数据未显示）获得最小的油量23.5%[8]。从表1可以看到，在恒沸溶剂里油的提取量明显少于在纯溶剂里提取量，这可能是由于水的存在降低了油的溶解度。在异丙醇油的提取量更高，但从安全措施方面讲，可以使用乙酸乙酯。因为异丙醇在较高温度转化成酮类化合物，危害人体健康。
3.3 NGPP46籽油相关的物理和燃料性质
使用乙酸乙酯（极性）和正已烷（非极性）有机溶剂提取优质基因型水黄皮NGPP46的种子的油脂测定其理化性质，是生物柴油的重要方面。表2给出了从两种不同的溶剂（正已烷和乙酸乙酯）提取出来的籽油的燃料相关物理性质的对比研究数据。
正已烷和乙酸乙酯提取NGPP46基因型的籽油，发现了0.927Kg/L和0.932 Kg/L的密度差别。这种水黄皮籽油的密度尽管类似于其它植物油的密度，但按照目前ASTM（美国材料试验协会）要求和欧洲对汽车柴油燃料的规格（prEN:590:2003），这个密度是高于柴油密度范畴（0.820-0.845 Kg/L）。因此，这种植物籽油的容积计量燃料情况在现代柴油机的单位喷油器的使用可能会导致更大量的消耗。普通柴油热值是45.4MJ/Kg，而那些从正已烷和乙酸乙酯这两种溶剂提取的NGPP46基因型的籽油的热值分别是44.34 MJ/Kg及42.88 MJ/Kg。据报道，这种籽油具有较低能量含量是由于脂肪酸链中存在化学界氧[17]。但是，基于其高密度和高体积的性质，这种水黄皮的籽油能量含量是很接近柴油燃料的。
因为液体燃料的流动需要通过管道，喷油器嘴，孔口以及在燃汽缸里雾化，因此其黏度很重要[3]。用正已烷和乙酸乙酯这两种溶剂提取NGPP46的油实验所得的籽油的运动黏度分别是24.9和26.3mm2/s。据报道，用这种水黄皮籽油制备生物柴油的运动黏度低于其他植物油制备的生物柴油的运动黏度（40℃下，30-40 mm2/s）[15]。对降低水黄皮的籽油酯类运动黏度以及提高它在柴油机中引擎性能，热分解和乳化都是推荐的方法[18]。这种优质基因型NGPP46在已经报道的非极性溶剂提取出来的的油脂燃点是205℃，而用极性溶剂提取的油脂燃点是215℃，这个燃点数据相对其他植物油来说是较低的，但是比传统的柴油的燃点（55℃）要高得多。所有的植物油都具有较高的燃点，因此认为它们在正常的情况下是安全的燃料。这是早期关于水黄皮油脂报告中说明其具有高黏度，高燃点，但是经过化学改良就可满足作为潜在生物柴油的替代条件要求[4]。以十六烷指数计算，用正已烷提取所得的水黄皮的籽油的十六烷值为35，这个数值是所有植物油典型的十六烷值指数范围，这种NGPP46籽油的酯类的十六烷值有所增加。高燃点，高十六烷值，从自燃和撞击性能的角度来说都是很好的观察点。在我们的试验中，我们记录了用正已烷和乙酸乙酯提取的NGPP46这种籽油的浊点分别是4℃和9℃，NGPP46的籽油具有相对其他植物油较低的浊点。此外，用乙酸乙酯提取的这种籽油的倾点是最大的，其倾点为3.7℃，并在报道过植物油的倾点12-13℃范围里[3]。一个常用籽油缺点是在冬季其流动性能不佳[19]。使用反凝胶添加剂或者通过汽车排放的尾气循环维持燃料箱温度，有效的克服了冬季籽油流动性能不佳的问题[20]。实验结果很明显，用不同极性的溶剂提取的NGPP46籽油的物理性质没有很大区别，小部分正已烷籽油显示关于燃料的物理性质只有点微小的改善。
3.4 脂肪酸组成
表3显示水黄皮CPT的正已烷中籽油分数，揭示了其脂肪酸组成。这种脂肪酸有因包含了一个碳原子为偶数的酮糖化合物优势，特别是在水黄皮中C16和C18的籽油。这种籽油的总饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸分数分别是为20.5%和79.4%（表3）。脂肪酸组成显示了在籽油中低分子量的脂肪酸，像月桂酸、葵酸所占分数非常小，大约是0.1%（表3）。十二烷酸的浓度也是很小的，小于0.8%，但高于上述的两个脂肪酸。饱和脂肪酸主要是棕榈酸（10.8%），接着就是硬脂酸（8.7%）。早期研究报导中也说到在水黄皮籽油中总饱和脂肪酸是高于其他籽油的[21]。水黄皮的单不饱和脂肪酸主要是油酸（46%），亚油酸（27.1%），亚麻酸（6.3%），这三种主要单不饱和脂肪酸构成了总多不饱和脂肪酸。这种籽油的不饱和脂肪酸组成与早期研究报导中说到的该种籽油中不饱和脂肪酸组成是不一致的[1，2，22]，造成早期研究报导的与本次实验所得的脂肪酸组成差异，可能是实验所用种子材料不一样，也就是说植物生长的生态环境与基因型都有所差异。正如植物生长的当地土壤与与环境因素起着至关重要的作用，一种特别的植物的特征是种质资源丰富，传授花粉的区域具有独特的传授特性，这些都是众所周知的事情，因此在本次实验研究和早期研究水黄皮籽油的脂肪酸组成有所差异不足为奇，并且本次实验研究结果可能相比早期研究要好些。值得注意的是任何物质的分析，应要从植物材料选出相具有代表性的植物材料，以及根据不同地方的植物材料，要注意定量和定性变化。
3.5 抗菌和抗真菌检测
虽然在传统的医学系统中使用都有使用不现地方的水黄皮来治疗各种皮肤病，此外水黄皮也被广泛应用于杀虫和杀线虫剂，抗真菌剂，抗菌剂，抗病毒药中[23-35]。但是目前并没有研究报导提到优质基因型水黄皮籽油的抗菌药物活性，以及抗病毒指数。
优质基因型（NGPP46）的水黄皮籽油抑制微生物生长的所有实验结果数据显示，最小抑制生长籽油浓度为50%（除副伤寒沙门氏菌），观察到的最大抑制生长籽油浓度为90%（表4），而DMSO的最大抗菌籽油浓度数据是100%。水黄皮籽油显示了肠球菌，单核细胞增生李斯特菌，大肠杆菌，副伤寒沙门氏菌的最大抗菌活性[表4]。各类研究都有报导亚麻酸，亚油酸和油酸中的不饱和脂肪酸长链对潜在的抗菌和条真菌方面具有重要意义[26,27]。在抗真菌的分析试验中，纯橄榄油的最大抑制生长浓度是100%，最小的抑制生长浓度是40%-50%（数据未显示）。在所有抗真菌试验中，甲恶唑抗生素是最有效的。籽油的抗黑曲霉活性最强，接着是土曲霉和白念球菌（表4）。水黄皮CPT籽油抗微生物生长试验的最小抑菌浓度MIC见表四。在目前的研究中，用正已烷提取的水黄皮籽油的抗菌剂筛选的真菌和细菌培养试验，显示了变种籽油抗真菌的效果比抗细菌的效果好。受籽油作用的抑制微生物生长区（单核细胞增生李斯特菌和土曲霉），如图2所示。早期研究报导了亚麻酸，亚油酸和油酸对抗园林植物的病害中表现的抗真菌活性指数[28]，因此水黄皮的各种不饱和脂肪酸作为抗菌药物应用的可能性值得关注。水黄皮籽油对细胞膜破坏可能就是一个作用机制，微生物细胞膜被破坏之后，其酶、转动蛋白的活性降低，细胞发生粘连。本次研究结果与时期研究报导[9，10]关于水黄皮提取的籽油的抗真菌及细菌性病原体的高效性的结果是一致的。另外也有一些研究报导也提高了其抗菌和抗真菌的作用机理[29]。水黄皮的籽油对所有抑制微生物生长的试验中都有效的抗其生长的最小抑制生长浓度MIC是大约是50%。这个结果令人关注的是要确认这种籽油重要的化学成分组成，了解其相关性质以及它的抗菌活性。
因本次对水黄皮的调查，证明了它的使用潜在性，水黄皮的生物活性也因此被挖掘是具有引领开发新药物天然药物资源。假如水黄皮的活性成分被提纯，净化和足剂量，适当的使用可加强其抗菌活性。如果从自然界的有机化合物中筛选出来像水黄皮的抗菌物质以及鉴定活性成分，肯定是一个卓有成效，意义非凡的研究，并且可以更新以前的抗菌化疗药物。在目前水黄皮籽油小部分正已烷的研究，已经证实了其被用来作抗菌剂药物来源，具有很高的潜在可塑性，目前水黄皮的抗菌剂可塑性研究正在进行。
4 结论
针对目前有限供应的天然矿物燃料，水黄皮毫无疑问是很重要的植物原料来源和生物柴油的潜在的资源，这份研究报告说明了水黄皮的应用意义。目前对普通的石化柴油的各种理化性质的研究数据，以及本次研究结果数据表明了NGPP46（CPT）籽油是非常接近普通的石化柴油重要的理化性质生物柴油，使得它应用在CI引擎系统中一种潜在的燃料。分离出NGPP46的籽油，也明显的显示出其对致病微生物选择性的抗菌，抗真菌活性。本次研究为CPT添加了一个属性特征， 对于利用种质具有很重要的意义，并建立一个生物柴油物种遗传的基因强化研究档案（夏雨阳，个人通信）。然而，进一步的研究需要估算研究成本，考虑研究成效和籽油及其籽油产品的安全性。我们目前对NGPP46籽油的化学成分和生物鉴定的研究结果，可能会帮助到在在生物柴油物种遗传增强方面，解决关键性问题。
摘 要
本研究对水黄皮优良种种籽籽油进行了理化特性与抗菌活性分析。用正已烷抽提的种籽有最高的出油率，可达33%，籽油的理化特性确立了其作为潜在生物燃料作物的可行性；通过气相色谱-质谱联谱分析发现：其单不饱和脂肪酸总量（油酸46%）要高于多不饱和脂肪酸总量（33%）。对用于检测的真菌与细菌培养物，籽油也同时显示了其抑菌作用，即使该抗菌活性在四个浓度梯度（50%，80%，90%和100%）下有浓度依赖性。研究结果进一步证实了具有优良种优良特征水黄皮的籽油可用作柴油与药物。
关键词：抗菌活性，生物柴油，CPT，水黄皮，籽油
1 简介
油产量高的作物对于经济增长的能量和农业部门是非常重要的。籽油的多不饱和脂肪酸是生物柴油[1，2]的重要来源。这些有机籽油在物理化学特性和生物降解性方面比柴油燃料好。[3]这种植物就是直属豆科植物类的水黄皮。
水黄皮又称印度毛鱼藤，是一种生长在印度和缅甸的土地肥沃的沿海岸和河堤单型种属。这种树因它广泛的用途和作为一种潜在的生物柴油来源植物而闻名[4]。有报道称这种树称含油量平均大约28-34%，并且多不饱和脂肪酸的含量比例高[1]。回顾历史，水黄皮一直被用作民间的药用植物，尤其是印度医学中的韦达养生学和悉达打坐系统[5]。这种植物的所有部分早已被用来作为治疗肿瘤、痔疮、皮肤病、瘙痒、脓肿、风湿关节痛、腹泻、溃疡等的药材。[5，6]除此之外，水黄皮在动物饲料、绿色肥料、木材和鱼的毒药中的应用也是很有名。水黄皮在农业和生态环境中操纵﹙的﹚杀虫和杀线虫活跃性也是被公认的。近期，一个生物药的原始资料历史记录说，确切的说明了作为抗菌和治疗药物的水黄皮的效力。
然而，要使用这个物种进行生物柴油的一个原料和生物医学领域更多研究，是有必需的。增加生物柴油的生产重要的是要有一种优质的基因型，即能结出油量能的水黄皮的种子。这种选出来的基因型加上树体（CPT）就是一颗比其他基因型具有优越形态特征的个体树（树的直径，树的高度，重叶子的数量，蓓蕾的数量，花朵的数量，种子的数量）[8]。我们先前在整个水黄皮研究体系中的表征和籽油分析，使我们对标签的优质基因型在北瓦天然生物种群发现计划在内的基因改良的物种[8]。虽然曾经个别地报导这种植物的籽油的化学成分和生物测定[9-11]，但目前还没有系统的研究或者有关研究成果去描述这种优质基因型籽油的组成和它的作为致病的指数的微生物效力的有效攻击范围。
在当前的研究报告中报告在北瓦，阿萨姆，印度发现水黄皮天然种群的稳定的基因型CPT（下文参考原始标签号码为NGPP46）鉴定是基于这种籽油的成分和连续两个形态学性状季节（消除季节性误差或地方误差的可能性）是下一步研究进行的发展目标：
①使用不同的溶剂和利用不同的恒沸溶液对这种种子进行提取这种基因型籽油和籽油产量定量化
②利用正乙烷和乙酸乙酯的分数来分析并比较这种基因型籽油的理化性质
③由出产比例分数最大油来确定这种基因型籽油的脂肪酸组成
④通过这种籽油的抗已标记的真菌和细菌菌株的试验进行探讨这种基因型籽油的抗菌活性。
2 材料和方法
2.1 植物材料
在目前现有的研究使用2007年四月到五月期间在尸罗森林山脉，北瓦（26°14’6”N，91°41’28”E），阿萨姆邦的水黄皮（NGPP46）的CPT个体特征的水黄皮的健康和完全成熟的种子。这种水黄皮优质基因型的特点有优势的属性，即拥有用作转成生产具有理想质量高量最大油量的种子的树体[8]。 把大约1Kg的NGPP46种子放到65℃的烘箱中烘大概5-7天，直到干重不变，然后对其研磨粉碎，在4℃下储存备用（最久可以保存3-6个月），并作为下面的实验材料。
2.2 提取油脂
按照索AOAC（美国石油化学学会）的氏提取法标准的程序[12]称取100g上面已经制备好的干种子粉末，使用不同的溶液（正已烷、石油醚、乙酸乙酯、异丙醇）的沸点。利用恒沸溶液（乙酸乙酯（91.53%）+水（8.47%），异丙醇（87.8%）+水（12.2%））沸点，提取种子粉末中的油脂。提取的油脂时，沸腾物在减压蒸馏下受到单一的升华与蒸发，可以把溶剂全部提取出来，油脂随溶剂被蒸馏出来，最后得到油脂。油脂的含量用干种子的重量的百分比表示。提取出来的油脂在4℃下最久可以储存一个月备用，并作为下面进行公演分析和生物活性研究的实验材料。
2.3 籽油物理性质的测定
正已烷提取出来的水黄皮籽油基本的物理、化学和燃料的相关性质，根据美国ASTMT和AOAC标准实验程序，进行试验。其分子数、颜色、气味、折射指数、密度、酸值、浊点、倾点、运动黏度、热值、以及燃点[12，13]，以十六烷值为根据进行计算，可以确定上面提到的物理性质参数。
2.4 气相色谱-质谱分析
取部分正已烷相通用气相色谱-质谱分析仪器进行分析。把1μl上面实验提取出来的正已烷注入在分裂式的CBP-5模式融合的二氧化硅毛细管柱（含5%苯基甲基聚乙烯硅氧烷，规格30米长*0.25毫米直径 *0.25毫米厚度）里，将毛细管放到设定初始温度为60℃，最终温度为260℃的250℃的检测室里（每分钟增加5℃），当超过平衡时间1.01分钟，氦载气压力为100KPa，流速为50ml/min，界面温度为300℃时，抽样3min。以微软图书馆中威利139.LIB鉴定程序为试验标准对脂肪酸进行鉴定。
2.5 抗菌和抗真菌检测
细菌培养，即在富营养的琼脂培养基里（偏4-5℃下储存）培养的单核细胞增多性李斯特杆菌、大肠杆菌（MTCC108），小肠结肠炎耶尔森氏菌（MTCC859）、副伤寒沙门氏菌，再接种到10ml的营养肉汤中，在37℃培养一个晚上。取一支培养好的肉汤培养基，吸取1ml培养过的营养肉汤到9ml的营养肉汤中(Hi-media)培养48h后通过离心分离提取细胞物质（在2795的转速下离心5min），再用生理盐水进行洗涤不溶的悬浮物。另外取100μl的培养液均匀的涂抹在已经凝固的琼脂平板上，并利用菌落在培养基中扩散方法进行这种分析试验，24小时后观测生长抑制区并记录结果。
真菌斜面培养法，即在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中培养黑曲霉、土曲霉、白色念珠菌。再从不同真菌菌株的孢子悬浮培养体中各取培养液（300μl，106 ml孢子），并均匀涂抹在凝固的察氏琼脂培养基（CDA）平板上。培养48h之后观察并用相同的方式去描述细菌培养物情况，并且记录结果。氨苄西林（USB的50ml/ml试剂盒）还有甲恶唑（100μg/盘的Hi-media）作积极有效控制药物，以去除圆盘直径区（6mm）后用直径区来描述抑制作用的结果（mm）±SD。依据培养结果得出由正已烷提取出来的水黄皮（NGPP46）籽油的最小抑菌浓度（MIC）[14]。用纯二甲基亚砜（DMSO）中稀释籽油，并稀释成不同浓度的（35%-100%），记录最低抑菌浓度（MIC）。细菌和真菌培养物分别涂抹在琼脂平板24-48h之后，根据培养情况提供的检测样品抑制微生物的有形增长情况，得出最低的稀释度。
2.6 统计分析
每个化验样品，都进行了三次检测，用SPSS16.0单因素方差分析软件（ANOVA）分析了这些数据表明前面文献提供的平均值和标准都是成实验结果一不致的。通过LSD测试法来测试了方法之间的差异，并都认为是显著水平在p < 0.05下差异水平有显著性。
3 结果与讨论
3.1 植物材料
要使水黄皮成为一种有效、经济和潜在的生物柴油植物，应具备有生物柴油等特性具有十分重要的意义，比如能高产含油量高及油品质好的种子。这种选出来的基因型加上树体就是一棵比其他基因型具有优越形态特征的水黄皮个体树。在北瓦，阿萨姆天然群体生长的50棵标记的树（每棵树的基因型都不一样），根据对多个营养生长和生殖生长标记，鉴定了十CPT属于两个不同的种群（6和10）。从对于油产量最重要的两个方面即小花数和荚果种子性状分析了这十种CPT，对在第二阶段中长得最好的进行鉴定基因型[8]。最好的CPT报告 (下文参考原始标签号码为NGPP46，图1)为下面试验进一步确定其物理和化学成分与燃料有关的性质，以及测定籽油的生物致病指数。
3.2 油脂提取及含量
这种优质基因型水黄皮的优越属性特征就是它们能高产含油量高的种子。因此，下一个重要步骤就是为从种子或籽核中获得最大油量来制备生物柴油，必须使用正确的提取油脂技术。如表1所示，采用不同的溶剂使用索氏提取法提取籽油产量在26.0%-33.0%范围之间。提取出来的油脂颜色黑暗并有一股难闻的气味。使用正已烷作溶剂用索氏提取法的提取到的最大油量接近33%。使用有机溶剂的优点是溶剂能回收重复使用，回收溶剂过程容易，这方便实施和逐渐广泛应用于许多潜在的生物柴油植物[15]。
对于所有的提取，种子与溶剂一般所用的比例为1:6（体积比），并发现这个比例是在更短的时间内获得更高产量具有优质质量的油脂的最好比例[8]。 然而，研究发现，最少的时间是使用非极性溶剂提取（正已烷和石油醚）。而在极性溶剂的（乙酸乙酯和异丙醇）恒沸溶液，所用的提取时间是用非极性提取等量籽油时间的两倍多。把水当作提取溶剂，使用热水浴提取的方法（数据未显示）获得最小的油量23.5%[8]。从表1可以看到，在恒沸溶剂里油的提取量明显少于在纯溶剂里提取量，这可能是由于水的存在降低了油的溶解度。在异丙醇油的提取量更高，但从安全措施方面讲，可以使用乙酸乙酯。因为异丙醇在较高温度转化成酮类化合物，危害人体健康。
3.3 NGPP46籽油相关的物理和燃料性质
使用乙酸乙酯（极性）和正已烷（非极性）有机溶剂提取优质基因型水黄皮NGPP46的种子的油脂测定其理化性质，是生物柴油的重要方面。表2给出了从两种不同的溶剂（正已烷和乙酸乙酯）提取出来的籽油的燃料相关物理性质的对比研究数据。
正已烷和乙酸乙酯提取NGPP46基因型的籽油，发现了0.927Kg/L和0.932 Kg/L的密度差别。这种水黄皮籽油的密度尽管类似于其它植物油的密度，但按照目前ASTM（美国材料试验协会）要求和欧洲对汽车柴油燃料的规格（prEN:590:2003），这个密度是高于柴油密度范畴（0.820-0.845 Kg/L）。因此，这种植物籽油的容积计量燃料情况在现代柴油机的单位喷油器的使用可能会导致更大量的消耗。普通柴油热值是45.4MJ/Kg，而那些从正已烷和乙酸乙酯这两种溶剂提取的NGPP46基因型的籽油的热值分别是44.34 MJ/Kg及42.88 MJ/Kg。据报道，这种籽油具有较低能量含量是由于脂肪酸链中存在化学界氧[17]。但是，基于其高密度和高体积的性质，这种水黄皮的籽油能量含量是很接近柴油燃料的。
因为液体燃料的流动需要通过管道，喷油器嘴，孔口以及在燃汽缸里雾化，因此其黏度很重要[3]。用正已烷和乙酸乙酯这两种溶剂提取NGPP46的油实验所得的籽油的运动黏度分别是24.9和26.3mm2/s。据报道，用这种水黄皮籽油制备生物柴油的运动黏度低于其他植物油制备的生物柴油的运动黏度（40℃下，30-40 mm2/s）[15]。对降低水黄皮的籽油酯类运动黏度以及提高它在柴油机中引擎性能，热分解和乳化都是推荐的方法[18]。这种优质基因型NGPP46在已经报道的非极性溶剂提取出来的的油脂燃点是205℃，而用极性溶剂提取的油脂燃点是215℃，这个燃点数据相对其他植物油来说是较低的，但是比传统的柴油的燃点（55℃）要高得多。所有的植物油都具有较高的燃点，因此认为它们在正常的情况下是安全的燃料。这是早期关于水黄皮油脂报告中说明其具有高黏度，高燃点，但是经过化学改良就可满足作为潜在生物柴油的替代条件要求[4]。以十六烷指数计算，用正已烷提取所得的水黄皮的籽油的十六烷值为35，这个数值是所有植物油典型的十六烷值指数范围，这种NGPP46籽油的酯类的十六烷值有所增加。高燃点，高十六烷值，从自燃和撞击性能的角度来说都是很好的观察点。在我们的试验中，我们记录了用正已烷和乙酸乙酯提取的NGPP46这种籽油的浊点分别是4℃和9℃，NGPP46的籽油具有相对其他植物油较低的浊点。此外，用乙酸乙酯提取的这种籽油的倾点是最大的，其倾点为3.7℃，并在报道过植物油的倾点12-13℃范围里[3]。一个常用籽油缺点是在冬季其流动性能不佳[19]。使用反凝胶添加剂或者通过汽车排放的尾气循环维持燃料箱温度，有效的克服了冬季籽油流动性能不佳的问题[20]。实验结果很明显，用不同极性的溶剂提取的NGPP46籽油的物理性质没有很大区别，小部分正已烷籽油显示关于燃料的物理性质只有点微小的改善。
3.4 脂肪酸组成
表3显示水黄皮CPT的正已烷中籽油分数，揭示了其脂肪酸组成。这种脂肪酸有因包含了一个碳原子为偶数的酮糖化合物优势，特别是在水黄皮中C16和C18的籽油。这种籽油的总饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸分数分别是为20.5%和79.4%（表3）。脂肪酸组成显示了在籽油中低分子量的脂肪酸，像月桂酸、葵酸所占分数非常小，大约是0.1%（表3）。十二烷酸的浓度也是很小的，小于0.8%，但高于上述的两个脂肪酸。饱和脂肪酸主要是棕榈酸（10.8%），接着就是硬脂酸（8.7%）。早期研究报导中也说到在水黄皮籽油中总饱和脂肪酸是高于其他籽油的[21]。水黄皮的单不饱和脂肪酸主要是油酸（46%），亚油酸（27.1%），亚麻酸（6.3%），这三种主要单不饱和脂肪酸构成了总多不饱和脂肪酸。这种籽油的不饱和脂肪酸组成与早期研究报导中说到的该种籽油中不饱和脂肪酸组成是不一致的[1，2，22]，造成早期研究报导的与本次实验所得的脂肪酸组成差异，可能是实验所用种子材料不一样，也就是说植物生长的生态环境与基因型都有所差异。正如植物生长的当地土壤与与环境因素起着至关重要的作用，一种特别的植物的特征是种质资源丰富，传授花粉的区域具有独特的传授特性，这些都是众所周知的事情，因此在本次实验研究和早期研究水黄皮籽油的脂肪酸组成有所差异不足为奇，并且本次实验研究结果可能相比早期研究要好些。值得注意的是任何物质的分析，应要从植物材料选出相具有代表性的植物材料，以及根据不同地方的植物材料，要注意定量和定性变化。
3.5 抗菌和抗真菌检测
虽然在传统的医学系统中使用都有使用不现地方的水黄皮来治疗各种皮肤病，此外水黄皮也被广泛应用于杀虫和杀线虫剂，抗真菌剂，抗菌剂，抗病毒药中[23-35]。但是目前并没有研究报导提到优质基因型水黄皮籽油的抗菌药物活性，以及抗病毒指数。
优质基因型（NGPP46）的水黄皮籽油抑制微生物生长的所有实验结果数据显示，最小抑制生长籽油浓度为50%（除副伤寒沙门氏菌），观察到的最大抑制生长籽油浓度为90%（表4），而DMSO的最大抗菌籽油浓度数据是100%。水黄皮籽油显示了肠球菌，单核细胞增生李斯特菌，大肠杆菌，副伤寒沙门氏菌的最大抗菌活性[表4]。各类研究都有报导亚麻酸，亚油酸和油酸中的不饱和脂肪酸长链对潜在的抗菌和条真菌方面具有重要意义[26,27]。在抗真菌的分析试验中，纯橄榄油的最大抑制生长浓度是100%，最小的抑制生长浓度是40%-50%（数据未显示）。在所有抗真菌试验中，甲恶唑抗生素是最有效的。籽油的抗黑曲霉活性最强，接着是土曲霉和白念球菌（表4）。水黄皮CPT籽油抗微生物生长试验的最小抑菌浓度MIC见表四。在目前的研究中，用正已烷提取的水黄皮籽油的抗菌剂筛选的真菌和细菌培养试验，显示了变种籽油抗真菌的效果比抗细菌的效果好。受籽油作用的抑制微生物生长区（单核细胞增生李斯特菌和土曲霉），如图2所示。早期研究报导了亚麻酸，亚油酸和油酸对抗园林植物的病害中表现的抗真菌活性指数[28]，因此水黄皮的各种不饱和脂肪酸作为抗菌药物应用的可能性值得关注。水黄皮籽油对细胞膜破坏可能就是一个作用机制，微生物细胞膜被破坏之后，其酶、转动蛋白的活性降低，细胞发生粘连。本次研究结果与时期研究报导[9，10]关于水黄皮提取的籽油的抗真菌及细菌性病原体的高效性的结果是一致的。另外也有一些研究报导也提高了其抗菌和抗真菌的作用机理[29]。水黄皮的籽油对所有抑制微生物生长的试验中都有效的抗其生长的最小抑制生长浓度MIC是大约是50%。这个结果令人关注的是要确认这种籽油重要的化学成分组成，了解其相关性质以及它的抗菌活性。
因本次对水黄皮的调查，证明了它的使用潜在性，水黄皮的生物活性也因此被挖掘是具有引领开发新药物天然药物资源。假如水黄皮的活性成分被提纯，净化和足剂量，适当的使用可加强其抗菌活性。如果从自然界的有机化合物中筛选出来像水黄皮的抗菌物质以及鉴定活性成分，肯定是一个卓有成效，意义非凡的研究，并且可以更新以前的抗菌化疗药物。在目前水黄皮籽油小部分正已烷的研究，已经证实了其被用来作抗菌剂药物来源，具有很高的潜在可塑性，目前水黄皮的抗菌剂可塑性研究正在进行。
目 录
摘 要 1
1 简介 1
2 材料和方法 2
2.1 植物材料 2
2.2 提取油脂 2
2.3 籽油物理性质的测定 2
2.4 气相色谱-质谱分析 2
2.5 抗菌和抗真菌检测 3
2.6 统计分析 3
3 结果与讨论 3
3.1 植物材料 3
3.2 油脂提取及含量 4
3.3 NGPP46籽油相关的物理和燃料性质 5
3.4 脂肪酸组成 6
3.5 抗菌和抗真菌检测 7
4 结论 9
针对目前有限供应的天然矿物燃料，水黄皮毫无疑问是很重要的植物原料来源和生物柴油的潜在的资源，这份研究报告说明了水黄皮的应用意义。目前对普通的石化柴油的各种理化性质的研究数据，以及本次研究结果数据表明了NGPP46（CPT）籽油是非常接近普通的石化柴油重要的理化性质生物柴油，使得它应用在CI引擎系统中一种潜在的燃料。分离出NGPP46的籽油，也明显的显示出其对致病微生物选择性的抗菌，抗真菌活性。本次研究为CPT添加了一个属性特征， 对于利用种质具有很重要的意义，并建立一个生物柴油物种遗传的基因强化研究档案（夏雨阳，个人通信）。然而，进一步的研究需要估算研究成本，考虑研究成效和籽油及其籽油产品的安全性。我们目前对NGPP46籽油的化学成分和生物鉴定的研究结果，可能会帮助到在在生物柴油物种遗传增强方面，解决关键性问题。