复合诱变黑曲霉发酵生产柠檬酸的研究

复合诱变黑曲霉发酵生产柠檬酸的研究

摘要

柠檬酸（citric acid）是动植物体内的一种天然成分和生理代谢的中间产物，是微生物发酵法生产的重要有机酸，用途极为广泛而有良好的发展前景。本研究从应用角度出发，在现有工作基础上，进一步开展柠檬酸发酵菌黑曲霉(Aspergillus niger)的选育研究，主要有紫外线照射、硫酸二乙酯以及亚硝酸等方法对柠檬酸发酵菌黑曲霉进行诱变。通过三种不同的方法进行诱变，并经过初筛、传代、选择性培养、筛选之后，共获得10株产酸相对较高的优良菌株，基本达到了试验的预期目标。在实验的最后我们根据实验的结果对于诱变的机理进行了分析和讨论。

主要结果如下:

(1)通过紫外线诱变的菌株试验得到了产酸最高的“YZ-UV-5”菌株。

(2)出发菌黑曲霉“YZ-35”在产柠檬酸的诱变过程中含量均有所提高。经过紫外线照射后的黑曲霉菌株产酸含量最高，较出发菌提高了81.60%，经过亚硝酸诱变后的黑曲霉菌株产酸含量较出发菌提高了54.17%，经过硫酸二乙酯诱变后的黑曲霉菌株产酸量较出发菌提高了44.10%。

关键词：柠檬酸、黑曲霉、菌种选育、诱变、紫外线、硫酸二乙酯

1 引言 5

1.1黑曲霉 5

1.2 黑曲霉的应用 6

1.3 产柠檬酸黑曲霉的诱变方法 6

1.3.1 紫外照射诱变 6

1.3.2 微波诱变 7

1.3.3 烷化剂(DES)诱变 7

1.3.4 碱基类似物诱变 8

1.3.5 新型的诱变方法 8

1.4 柠檬酸 8

1.4.1 柠檬酸的用途 8

1.5 本课题的研究意义 10

2 研究的主要内容 11

2.1 材料与方法 11

2.1.1 菌株 11

2.1.2 主要仪器和设备 11

表1 主要仪器与设备 11

2.1.3 主要试剂 12

表2 实验试剂表 12

2.1.4 培养基 12

2.1.5 悬浮液制备 13

2.1.6 相关试剂的制备 13

2.1.7 试验方法 14

3结果与分析 15

3.1氢氧化钠浓度标定的结果 15

3.2 紫外线诱变筛选结果 16

3.3硫酸二乙酯（DES）诱变筛选结果 17

3.4 亚硝酸诱变筛选结果 18

结论 19

参考文献 20

致谢 21

本课题的研究意义

目前以淀粉质原料发酵菌株主要以黑曲霉为主，黑曲霉是美国FAD认定的最安全菌种之一，具有GRAS资格。黑曲霉所产的酶系具有安全性好，应用范围广的优点。由于黑曲霉可以产生丰富的淀粉酶、果胶酶、纤维素酶所以常被用于谷物淀粉原料的分解。很多产葡萄糖所选用的高活性糖化酶生产菌种就是黑曲霉的突变株。另外，为了提高饲料的利用率，很多饲料企业广泛的使用酶添加剂，而黑曲霉不仅可以发酵生产多种水解酶，满足作为饲料添加的要求，大幅度降低成本，而且还有高度的安全性，只要原料符合卫生要求，可直接作为饲料添加剂。更重要的是柠檬酸行业中，黑曲霉主导地位不可替代。它在食品、化工、医药、建筑、印染、皮革、洗涤剂等行业有广泛的用途，市场需求增长迅速，所以研究黑曲霉在工业生产中有着重大的实际意义。产柠檬酸黑曲霉已经历了几十年的诱变筛选，对常用的诱变处理具有一定的抗性。中科院有人尝试把离子束应用于产柠檬酸黑曲霉的诱变，并取得了一定效果。在此影响下，有人做过用低能离子束注入黑曲霉来优化菌种的产酸能力。李文玲[16]等也曾经用Co60～γ射线诱变产柠檬酸的黑曲霉菌种，也取得了很大的成果。欧美是除中国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产的经济技术实力比较雄厚，一般都是集技术开发工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬酸行业，在技术和管理上具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。如何提高黑曲霉的产酸量是个技术的难题，且目前野生型菌株的柠檬酸产量相对较低，本研究通过复合诱变来提高其产柠檬酸能力，从我国的国情出发，方法简单易学，效果显著，生产分散，技术水平低的实际情况下具有一定的借鉴和推广意义。对于柠檬酸发酵行业，所用菌株的产酸能力是影响现代柠檬发酵生产关键因素。因此，利用各种诱变手段选育高产脂肪酶生产菌一直是国内外研究的重点。近年来，国内外有些对柠檬酸发酵菌种的选育研究报道，周定[17]等采用硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变选育一株变异株，其产酸率5.24%。尽管我国柠檬酸发酵技术在世界上并不落后，但在菌种选育方面的竞争形势很严峻[15]。

参考文献

[1] 微生物学/魏明奎主编.—北京:中国轻工业出版社，2010(9):65

[2] 微生物学/魏明奎主编.—北京:中国轻工业出版社，2010(9):343

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