毕业设计我帮你

碱性蛋白酶固定化研究及工艺设计

摘要

碱性蛋白酶是具有高度选择性、催化反应条件温和、对环境无污染等等优点的一种天然的大分子催化剂，这些优点使它在生化、食品加工、制药等行业有非常广阔的应用前景。然而, 游离酶的容易变性和不稳定等缺点,限制了其在工业化生产中的应用。此外, 从反应体系中分离和提纯酶也增加了其作为催化剂的成本。固定化酶技术正是在此条件下得以提出和发展的。

本论文以壳聚糖微球为载体，用戊二醛交联法固定碱性蛋白酶。用实验主要研究了碱性蛋白酶在以壳聚糖为载体的条件下戊二醛溶液浓度、温度、PH值、给酶量因素在固定化过程中的影响，并通过L9（34）正交试验优化，探索固定化碱性蛋白酶的最优方法及最佳工艺路线，并对固定化碱性蛋白酶进行性质评定及检验。经分析确定固定化碱性蛋白酶的生产工艺最优参数为：室温20℃下，载体加酶量为0.009g/ml，戊二醛浓度为1%交联，在缓冲体系为PH9下，固化4h，得到固定化碱性蛋白酶的活力和活力回收率可达到296.29U/g和62.4%；固定化碱性蛋白酶耐热性较游离碱性蛋白酶较强，随后，本论文采用优化后的生产工艺对碱性蛋白酶的固定化进行了工艺设计，并进行了实例检验。

关键词   碱性蛋白酶      壳聚糖微球    工艺设计

 

目录

第1章　绪论 1

1.1 固定化酶 1

1.1.1 固定化酶的产生背景 1

1.1.2 固定化酶的研究历史 1

1.1.3 固定化酶的性质 2

1.2 碱性蛋白酶简介 3

1.3 碱性蛋白酶固定化选择壳聚糖作载体的原因 3

1.4 碱性蛋白酶的固定化方法 4

1.5 固定化碱性蛋白酶活力的测定及计算 4

1.5.1 固定化碱性蛋白酶活力的测定 4

1.5.2 固定化酶活力回收率的计算 5

1.6 碱性蛋白酶固定化的研究现状 5

1.7 碱性蛋白酶在食品工业中的应用 5

1.7.1利用碱性蛋白酶提取大米水解蛋白 6

1.7.2 利用碱性蛋白酶水解血红蛋白 6

1.7.3 碱性蛋白酶在制作面包过程中的应用 6

第2章 固定化碱性蛋白酶的制备工艺研究 7

2.1 仪器与试剂 7

2.1.1 仪器设备 7

2.1.2 原材料与主要试剂 7

2.2 实验方案 8

2.2.1 壳聚糖微球的制备 8

2.2.2 给酶量对酶固定化效果的影响 8

2.2.3 pH 值对酶固定化效果的影响 9

2.2.4 戊二醛溶液浓度对酶固定化效果的影响 9

2.2.5 固定化温度对酶固定化效果的影响 9

2.2.6 固定化碱性蛋白酶活力的测定 10

2.2.7 固定化碱性蛋白酶的性质评定 11

2.2.8 固定化碱性蛋白酶在玉米肽中的应用 11

2.3 结果与讨论 11

2.3.1 单因素给酶量对酶固定化效果的实验结果分析 11

2.3.2 单因素PH值对酶固定化效果的实验结果分析 12

2.3.3 单因素戊二醛浓度对酶固定化效果的实验结果分析 13

2.3.4 单因素温度对酶固定化效果的实验结果分析 14

2.4 正交实验 15

2.4.1 正交试验因素水平表 15

2.4.2正交试验结果与极差、方差分析 16

第3章 固定化碱性蛋白酶生产工艺设计研究 19

3.1 固定化碱性蛋白酶的最优工艺条件 19

3.2 生产工艺要点 19

3.2.1 设备选型 19

3.2.2 操作要点 19

3.3 固定化碱性蛋白酶的生产工艺流程 20

3.4 固定化碱性蛋白酶的性质评定 21

3.4.1 固定化碱性蛋白酶的最适温度 21

3.4.2 固定化碱性蛋白酶的最适PH值 22

3.5 固定化碱性蛋白酶在玉米肽制备中的应用实例 22

结论 24

参考文献 25

 

结论

本文在简要介绍了固定化酶的来源，功能，近期国内外的发展情况。重点介绍了用戊二醛交联法固定以壳聚糖微球为载体的碱性蛋白酶的工艺研究，并对固定化碱性蛋白酶的制备工艺进行了实验设计，优化出了最佳的工艺配方，并对各因素进行正交试验设计，通过方差分析和极差分析得出了影响固定化碱性蛋白酶的因素，并对固定化后的蛋白酶进行了性质评测和实例检验。

1、通过单因素实验，确定最佳固定化条件

    通过实验研究影响固定化效果的四个主要因素：给酶量，PH值，戊二醛浓度，温度。通过查阅文献，考察的给酶量(g/ml)为0.008，0.009，0.01，0.011，0.012；PH值为7，8，9，10，11戊二醛浓度（体积分数）为0.5%,1%,1.5%,2.0%,2.5%；温度为15℃，20℃，25℃，30℃，35℃。由单因素实验得出最佳生产工艺条件为：给酶量：0.009g/ml，PH值：9，戊二醛浓度：1%，温度：20℃。

2、通过正交实验，确定影响固定化碱性蛋白酶的主次因素

    通过正交试验，得出本实验的四个因素对固定化碱性蛋白酶不同的影响，其中戊二醛浓度对浸提结果影响最大，各因素影响依次为：戊二醛浓度>温度>给酶量>PH，研究结果表明固定化碱性蛋白酶的最佳工艺条件是戊二醛浓度选择1%，固定化温度20℃，给酶量0.009g/ml，PH为9，固定时间4h。

3、通过性质评测，证明固定化碱性蛋白酶的益处

    通过性质评测，证明被固定化后的碱性蛋白酶与游离酶相比对热不再那么敏感，不会因为温度的升高而容易失活，酸碱度对其影响亦是如此。在50～70℃和pH9.0～12.0范围内依然有较高的酶活力。

4、通过实例验证，验证固定化碱性蛋白酶的实际应用性

    通过固定化碱性蛋白酶水解玉米肽实例，得出制得的固定化碱性蛋白酶的实际应用性。实验最终测得水解度为30.7%。说明制得的固定化碱性蛋白酶在实际酶解中具有良好的应用效果。

参考文献

[1]林松毅，宋龙凤，刘静波，于志鹏．壳聚糖微球固定碱性蛋白酶的研究[J]．食品科学，2008，29(11)：351

[2]武 军，陶 红，梁 歧.脱乙酰壳聚糖固定碱性蛋白酶的研究[J].食品科学，2005，26（9）：184

[3]张彦军, 田丰, 陈世谦.壳聚糖固定化酶的制备及应用[J].军事医学科学院院刊,2002,26(3):225

[4]侯利霞, 相朝清, 王金水, 赵舒畅.响应面法优化固定化碱性蛋白酶工艺[J].河北工业大学学报，2010,31（1）

[5]钟方旭, 张弦, 李春美.多孔壳聚糖微球固定化碱性蛋白酶的研究[J].食品科技，2007,8（8）

[6]郝继兴, 殷向彬, 刘兴旺, 路福平, 杜连祥.复合稳定剂对碱性蛋白酶的作用研究[J].化学与生物工程，2004,24（12）：47

[7]李民勤,闭春宇,徐慧显,何炳林. α，ω─二羧基聚乙二醇磁性毫微粒固定化碱性蛋白酶的研究[J].离子交换与吸附，1995,6

[8]夏 凡,琚争艳.微生物碱性蛋白酶在食品工业中的应用及其安全性研究进展[J].山东食品发酵，2008,2（149）

[9] 薛林贵.我国碱性蛋白酶的应用及研究进展[J].微生物学通报，1997，24(6):370

[10] 夏文水, 谭丽. 壳聚糖固定化酶研究进展[J]. 食品与机械, 2007, 23(6): 7-10.

[11] 张弦, 李春美, 钟方旭. 多孔壳聚糖微球的制备[J]. 食品科技, 2007,32(5): 33-40.

[12]张萍，侯红萍.新型酶固定化技术研究进展[J].酿酒科技，2010，6（192）：82-85

[13]陈巍, 罗志刚, 李忠彦, 熊三玉.天然多糖在酶固定化载体材料中的应用[J].中国调味品.2006,2（2）

[14]Shen F, Chen SJ, Dong XJ, et al. Supp ression of IL-8 gene tran2 scription by resveratrol in phorbol ester treated human monocytic cells[J]. J Asian Nat Prod Res, 2003,5(2)：151~157.

[15]Yu C, Shin Y G, kosmeder JW, et al. Liquid chromatography/tandem mass spectrometric determination of inhixition of human cytochrome P450 isozymes by resveratrol and resveratrol-3-sulfate[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2003, 17(4):307~313.

[16]Miura T, Muraoka S, Fujimoto Y. Inactivation of creatine kinase induced by stilbene derivatives[J]. Pharmacol Toxicol, 2002,90(2)：66~72.

[17]Hung L M, Chen J K, Huang SS, Ct al. Cardioprotective effect of resverarol, a natural antioxidant derived from grapes[J]. Cardiovasc Res, 2000,47：549~555

[18]Christian lmark, Markus Kneubuhl, Stefan Bodmer Occurrence and activity of natural antioxidants in herbal spirits. Innovative Food Science & Engineering Technologies, 2001, 239~243.

[19]Prochaska HJ. Santamaria AB. Direct measurement of NAD(p) H; quinine reductase from cells culfured in microtierwells; a screening assay for anticarcinogen icenzyme inducers[J]. Anal Biochem, 2008, 169：328~336.

[20]Andrea L H, Shazib P. Resveraratrol in cell fate decisions[J]. J Bioenerg Biomember, 2007,39：59~63.

[21]马静,李奉勤.正交试验法研究葛根口服液的制备工艺[J].亚太传统医药,2008,3, 4(3):43～44.