苏ICP备112451047180号-6
猪的SSR信息分析与EST-SSR的开发
摘要
在微卫星标记研究中，EST -SSR分子标记以其独特的优势，逐渐引起人们的关注。与此同时，数量迅速增加的ESTs为开发新的SSR标记提供了宝贵的资源。猪EST-SSR的不断开发也将为获取其更高实用价值的研究奠定坚实的基础。从NCBI公共数据库下载获得53029条猪EST，运用EST software去除其中低质量的和冗余的序列，得到4285条无冗余（Unigene）EST。在这些无冗余EST序列中检索出453条含有SSR的序列，其出现频率为10.57%。共检测出465个SSR位点，其中单核苷酸出现频率最高，占总SSR位点的79.78%（371/465）：其次是二核苷酸重复，占9.68%(45/465) ；三核苷酸重复占7.10%（33/465）；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复逐渐降低，依次为1.50%（7/465）、1.29%（6/465）、0.65%（3/465）。在所有重复基元中，A/T重复为主要类型，占所有重复的79.78%（371/465），其次为AG/CT、AC/GT、CCG/CGG、AAC/GTT，分别为5.16%（24/465）、3.44%(16/465)、2.80%(13/465)、1.72%(8/465)，不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。猪EST 资源中含有高频率的SSR位点，且EST-SSR 标记开发效率较高，本研究为猪EST-SSR标记的建立和进一步应用奠定了基础。
关键词： 猪；EST-SSR；重复基元
1. 前言
1.1 猪的实用价值及研究简述
猪早在7000年以前就被人类驯养，是人类最早驯化的家畜之一，且在地球上分布很广。猪不仅仅具有非常高的经济价值和研究价值，还具有丰富的营养保健价值和文化价值。
首先，猪的经济价值非常可观。例如2004年世界肉类总产量为25750万吨，其中猪肉产量为10039万吨，占了世界肉类总产量的39%[1]。其经济价值可见一斑。在我国，“猪粮安天下”充分诠释了生猪产业对国家社会、经济影响有着重大意义。猪肉是我国大多数城乡居民主要肉类消费品，在畜禽肉类产品消费中，猪肉约占65%，同时，猪肉价格在我国CPI指数权重高达6%。我国既是猪肉消费大国，也是生猪养殖大国，猪肉消费量和生猪养殖量均占世界总量的一半左右，均位居世界第一。生猪养殖业是我国畜牧业的主要组成部分，其产值约占畜牧业总产值的50%。据国家统计局数据显示：2010年生猪出栏6.67亿头，猪肉总量5070万吨，人均消费量达到37.8公斤[2]。此外，猪还可以为许多制成品提供很多的原料。例如猪皮是一种蛋白质含量很高的肉制品原料，以猪皮为原料用以加工皮花肉、皮冻、火腿等肉制品。
其次，猪的营养保健价值与文化价值也不禁让人惊叹。猪肉在人们日常生活中具有无可替代的食用营养功效，可是说它全身都是“宝”。它不仅可以补虚滋阴，而且还是养血润燥的良品之一。此外，猪肉还为人类补充丰富的必需氨基酸，微量矿物质以及维生素等，同时具有良好的保健功效。猪心对加强心肌营养，增强心肌收缩力有很大作用。猪肝可用于肝血不足，目昏眼干，夜盲等症[3]。此外，猪在我国还具有着独特的文化价值。猪从古至今是我国祭祀必备物品之一，是中国纪念和节庆的重要代表形式。哈佛人类学家詹姆斯·沃森称，如果重阳节不用猪进行祭祀，中国人的祖先会第二次极为痛苦的死去，灵魂彻底消灭。
最后，生物学研究价值也非常突出。猪也是人类生物学研究的极佳模型之一。它的基因组序列和染色体结构与人类高度同源，体型、生理学特征和疾病发展也与人类极其类似。与此同时，其窝产仔数多，繁殖速度快，克隆与转基因技术也极为成熟，拥有许多特性明确的细胞系可供利用[4] 。
畜禽类动物与人类的生产、生活息息相关，因此它们也是动物研究中重点之一。猪作为一种具有极高实用价值的畜禽动物之一，其生物学等方面的研究热潮也一直延续着！
国际上动物生物技术发展极为迅猛，畜禽动物基因组计划始于20世纪90年代初，1991年美国农业部同时资助启动了美国的猪、牛、鸡基因定位计划，即“国家动物基因组研究计划”；欧洲猪基因组计划定制于1989年，1990年正式启动；日本在1992年启动动物（猪和马）基因定位研究计划；中国也于20世纪末启动了家猪基因组计划[5]。随着基因方面研究的不断深入，研究成果也不断涌现。目前研究表明，猪的基因组与人类基因组有广泛的保守同源区域以及相似的染色体结构，于是有专家预测，猪可能是未来研究人类疾病理想的动物模型和外源器官移植的重要来源。正是由于猪重要的的经济及医学研究价值，许多关于猪的研究计划也先后被掀起。其中猪基因组的研究是研究的热点和重点[1]。
正是因为这些因素的不断积累，分子标记技术的应用研究也让人们眼前一亮。例如猪的分子标记辅助育种。同时这些应用也促进了新分子标记技术的研发，以EST为基础的SSR分子标记也以其独特的优势正吸引着众多科学研究者的眼球！
1.2 SSR信息分析简述与EST-SSR标记的优势及应用
简单重复序列（Simple sequence repeats, SSRs），是指以少数几个核苷酸（一般为2~6个）为基本单位多次串联重复的DNA序列[6]。与其他分子标记技术相比，SSR标记不仅具有孟德尔共显性遗传、操作简便、易检测、多态性好的优势，同时还具备了在基因组上分布均匀、特异性强、重复性好等长处，自20世纪90年代以来已经被遗传学家广泛应用。目前，SSR标记已经在基因定位作图、遗传多样性评价、构建基因图谱、鉴定个体及亲缘关系，标记辅助选择和数量性状位点（QTL）定位等研究领域彰显出了其巨大的应用潜力。根据序列性质不同，SSR标记主要分为基因组SSR（Genomic SSR, gSSR）和表达序列标签SSR（Expressed sequence SSR, EST-SSR）两种。
EST-SSR (表达序列标签微卫星)技术就是利用已有的EST 序列通过电子筛选鉴别SSR，然后根据SSR两端保守的侧翼序列设计引物，通过PCR 扩增基因组编码区的微卫星序列，将扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经银染后分析微卫星中核心序列重复单位数目的多态性。EST-SSR 标记来自于比较保守的转录区，具有良好的保守性，因此EST-SSR 在相关物种之间具有较高的可转移性和通用性。对于尚未进行EST 测序的物种，利用其近缘物种中已有的EST-SSR 标记或EST 序列来开发目标物种的新SSR 标记无疑会是一种行而有效的手段，这不仅加快了物种间的基因组信息转换，还为基因组研究提供了新的思路和途径。同时，EST-SSR反映了基因的编码部分，可以直接获得基因表达的信息，从而为功能基因提供“绝对”的标记，显现“真实的遗传多样性”。EST-SSR 省去了SSR 引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用了现有资源，降低了开发过程的成本，因此也正逐步成为一种发展最快、应用最广的分子标记技术。
基于EST序列开发的SSR标记，同基于基因组文库开发的SSR标记相比，有很多的优点：（1）节省资源。EST-SSR标记开发利用的是公共数据库中的EST序列，省去了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，这将节约了很多时间和测序等方面的费用，而基因组SSR分子标记的开发则必须对每个克隆个体进行筛选鉴定, 工作量大, 需消耗大量的资源, 而且效率还较低。例如在植物中已报道的阳性克隆比率约为2%~3%, 成功获得引物的机率则更低[7]；（2）高保守性和通用性。EST-SSR标记中的EST序列来自于比较保守的转录区，因此其在相关物种之间具有很高的可转移性和通用性，这使之在遗传多样性评价、遗传育种、比较作图和定位基因等研究中比基因组SSR更有价值；（3）简便快捷获取可靠基因信息。EST-SSR反映了基因的编码部分，可以直接获得基因表达的信息，为功能基因提供一个稳定的定位，可以对决定某些重要表型形状的等位基因进行直接鉴定；（4）EST-SSR高质量标记的比率要比基因组SSR高[8]。
从ESTs中开发的SSR标记已经在多种植物中有报道，如葡萄[9]、小麦[10]、玉米[11]和高粱[12]。而在动物中的报道却很少，研究主要集中于特殊生物类型。如斑马鱼[13]、鲶鱼[14]、火鸡[15]和人[16]等。近年来，我国学者也对一些常规动物进行了EST-SSR开发。如牙鲆[17]、鲤鱼[18]、山羊[19]和犬[20]。
1.3 猪EST-SSR信息分析的研究目的与意义
猪是具有很高实用价值的畜禽动物之一。然而，关于猪EST-SSR标记的相关报道却鲜有人问津。本研究对从NCBI数据库中获得的53029条猪EST序列，进行筛选、定位SSR位点，从而开发一些猪的新EST-SSR标记，这对于猪基因图谱的构建、QTL的定位和候选基因的分析、基因测序和分子标记辅助育种等研究都具有重要意义。此外，还有助于在基因层面改善其表观性状，改良品种。
2.讨论
SSR分子标记正逐步成为一种有效的、应用最广泛的分子工具，被广泛地用于遗传多样性、亲缘关系、连锁图谱构建、比较基因组学及关联分析等领域[23-25]。EST-SSR具有微卫星标记的多态性高、呈共显性遗传、数量丰富、易检测和在基因组中分布均匀等特点，又避免了传统方法中构建、筛选文库的繁琐步骤和人力物力的大量耗费；同时由于EST来源于基因的编码区，所以能在一定程度上直接、真实地标记功能基因，反映“真实的遗传多样性”；其次，由于引物设计自保守的侧翼序列，因此EST-SSR在不同物种间具有良好的通用性；相对于其他EST分子标记，EST-SSR又具有开发过程简单、成本低、基因定位准确等特点。EST-SSR标记也已相继在鲤鱼[18]、山羊[19]和犬[20]等多种动物中开发研究。研究结果表明，EST-SSR标记作为一种高效简便的分子标记，在遗传多样性评价、品种及亲缘关系的鉴定、遗传连锁图谱构建、比较基因组学研究、比较作图和新基因的定位筛选等研究方面都有着重要的用途[21]。
本研究开发了一些猪EST-SSR分子标记。从NCBI数据库中下载得到猪53029条EST序列，去除PolyA或PolyT以及冗余序列后，共得到4285条非冗余序列。在这些非冗余序列中，共含有465个SSR位点，SSR的发生频率为10.85%。EST序列的总长度为3085.10kb，从分布情况来看，平均每6.63kb就出现一个SSR即猪EST-SSR的平均距离为6.63kb，这说明猪中EST-SSR含量相对比较丰富。在去冗余之后得到4285条非冗余序列中，共发现含SSR位点的序列453条，占非冗余EST序列总数的10.57%。这个频率与植物相比，高于白菜的10.34%，并远远高于甘蔗的2.9%[26]、水稻的4.7%[27]、普通小麦的5.4%；与水产动物相比，这个频率高于牙鲆11.33%[17]，并远远高于鲤5.5%[28]。这种差异可能是物种间的真实SSR信息差异，也可能是运用MISA软件查找SSR时设定的重复次数的标准不同所致。
当四种不同碱基随机组合时，若EST-SSR数目足够大且无偏倚性，将可分别产生2、4、10、33、102和350种单、二、三、四、五、六核苷酸基本重复基元类型[29]。对猪EST-SSR的分析结果显示，各核苷酸基本重复基元都有出现，种类分别为1、4、5、6、5、3。与植物EST相对比，猪的EST分布表现了不同的特征：其一，大多数植物的EST-SSR 以三核苷酸和二核苷酸重复类型为主[30]，而猪却单核苷酸重复虽然只有一种，数量却占到了总数的79.78%，在数量上表现出明显的偏倚性。其二，重复基元的类型相对单调，下载了53029条的EST序列，重复基元却只有24种，重复类型上也呈现偏倚性。所出现这些偏倚性是猪EST-SSR的真实反映还是分析EST数量不足或者二者兼有之所造成，还需进一步研究。最终引物共合成4950条，对于检出的EST-SSR引物的可用性也进行了两方面的评价分析，其多态性分析需要做进一步的研究验证，不过凭借着高科技手段的有力支持，EST-SSR技术的高效性确实毋庸置疑，笔者对其在动物中的研究前景充满信心！
总之, 当前开发EST-SSR标记可作为基因组SSR标记的重要补充，这不仅将对于猪遗传图谱的绘制、功能基因的定位分析、分子标记辅助育种和种间亲缘关系的鉴定等研究产生积极的影响，而且还可以为其他畜禽动物的EST-SSR开发提供模板。
参考文献
[1] 陈静, 杜红丽, 张细权. 猪基因组研究进展[J]. 广东农业科学, 2007(5): 81-95.
[2] 北京首都农业集团有限公司. 2025年中国猪肉需求量将达5640万吨[Z]. 2011.3.29, http://www.52swine.com/xinwen/201103/24627.html..
[3] 猪的价值[Z]. 百度百科, 2015.5.27, http://www.chu-ying.com/show_zwh.aspx?Id=317..
[4] 史惠, 余权. 猪生物医学模型的基因组学研究进展[J]. 国外畜牧学-猪与禽, 2008 28 (3): 179-184.
[5] 兰旅涛, 董希慧, 郑国华等. 分子标记技术在现代猪育种中的应用现状与前景[J]. 江西农业学报, 2004 16 (2): 46-50.
[6] 闫秋良, 翟洪军, 刘臣. EST-SSR标记的开发及在动物研究中的应用[J]. 中国畜牧兽医, 2009,36 (7):102-105.
[7] 张增翠, 侯喜林. SSR分子标记开发策略及评价[J]. 遗传, 2004, 26 (5):763-768.
[8] 陈全求, 詹先进, 蓝家样等. EST分子标记开发研究进展[J]. 中国农学通报, 2008.9, 24(9):72-77.
[9] Scott K D, Eggler P, Seaton G, et al. Analysis of SSRs derived from grape ESTs[J]. Theor Aplied Genet, 2000, 100(5):723-726.
[10] Eujayl I, Sorrells M E, Baum M, et al. Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J]. Theor Applied Genet, 2002, 104(2-3):399-407.
[11] Kantety R V, Rota M L, Matthews D E, et al. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barly, maize, rice, sorghum and wheat[J]. Plant Mol Biol, 2002, 48(5-6):501-510.
[12] Morgante M, Hanafey M, Powell W. Microsatellites are preferentially associated with norepetitive DNA in plant genomes[J]. Hum Mol Genet, 2002, 30(2):194-200.
[13] Serapion J, Kucuktas H, Feng J, et al. Bioinformatic mining of type I microsatellites from expressed sequence tage of channel catfish (Ictalurus punctatus)[J]. Mar Biotechnol (NY), 2004,6(4):364-377.
[14] Ju Z, Wells M C, Martinez A, et al. An in silico mining for simple sequence repeats from expressed sequence tags of zebrafish, medaka, fundulus and xiphophorus[J]. In Silico Biol, 2005, 5(5-6):439-463.
[15] Dranchak P K, Chaves L D, Rowe J A, et al. Turkey microsatellite loci from an embryonic cDNA library[J]. Poult Science, 2003, 82(4):526-531.
[16] Haddad L A, Parra F C, Pena S D. Characterization and mapping of four novel human expressed polymorphic trinucleotide microsatellites[J]. Gene, 1998, 223(1-2):369-374.
[17] 刘奕, 陈伟兴, 周丹等. 基于公共数据库牙鲆EST-SSR的开发及特征分析[J]. 海洋渔业, 2013. 5, 35(2): 137-142.
[18] 顾颖, 曹顶臣, 张研等. 鲤与生长性状相关的EST-SSRs标记筛选[J]. 中国水产科学, 2009(1): 15-22.
[19] 赵传志, 李爱芹, 李长生等. 山羊EST资源的SSR分析[J]. 山东农业科学, 2009,(6): 6-9.
[20] 刘清神. DNA分子标记及其在犬中的研究进展[J]. 中国工作犬业, 2008(2):11-14.
[21] 张琼, 刘小林, 李喜莲等. EST-SSE分子标记在水生动物遗传研究中的应用[J]. 《水产科学》 2010 29(5): 302-306.
[22] 许忠能. 《生物信息学》[M]. 清华大学出版社2008 9第1版: 291.
[23] McCouch S R, Chen X, Panaud O, et al. Microsatellite marker development, mapping and application in rice genetics and breeding [J]. Plant Molecular Biology, 1997, 35: 89-99.
[24] Cardle L, Ramsay L, Milbourne D, et al. Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants [J]. Genetics, 2000, 156:847-854.
[25] Morgante M, Hanafey M, Powell W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes [J]. Nature Genetics, 2002, 30: 194-200.
[26] Cordeiro G M, Casu R, McIntyre C L, et al. Microsatellite markers from sugarcane (Saccharum spp. ) ESTs cross transferable to erianthus and sorghum [J]. Plant Sciences, 2001, 160( 6): 1115-1123.
[27] Kantety RV, La Rota M, Matthews D E, et al. Data mining for smiple sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat [J]. Plant Molecular Biology, 2002, 48( 5-6): 501-510.
[28] WANG D, LIAO X L, CHENG L, et a1. Development of novel EST—SSR markers in common carp by data mining from public EST sequences [J]. Aquaculture, 2007,(271):558—574.
[29] Rota L R, Kantety R V, Yu, J K. Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice, wheat, and barley [J]. BMC Genomics 2005(6):23.
[30] 李永强, 李宏伟, 高丽峰等. 基于表达序列标签的微卫星标记(EST-SSR)研究进[J]. 植物遗传资源学报, 2004, 5(1): 91-95.
摘要
在微卫星标记研究中，EST -SSR分子标记以其独特的优势，逐渐引起人们的关注。与此同时，数量迅速增加的ESTs为开发新的SSR标记提供了宝贵的资源。猪EST-SSR的不断开发也将为获取其更高实用价值的研究奠定坚实的基础。从NCBI公共数据库下载获得53029条猪EST，运用EST software去除其中低质量的和冗余的序列，得到4285条无冗余（Unigene）EST。在这些无冗余EST序列中检索出453条含有SSR的序列，其出现频率为10.57%。共检测出465个SSR位点，其中单核苷酸出现频率最高，占总SSR位点的79.78%（371/465）：其次是二核苷酸重复，占9.68%(45/465) ；三核苷酸重复占7.10%（33/465）；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复逐渐降低，依次为1.50%（7/465）、1.29%（6/465）、0.65%（3/465）。在所有重复基元中，A/T重复为主要类型，占所有重复的79.78%（371/465），其次为AG/CT、AC/GT、CCG/CGG、AAC/GTT，分别为5.16%（24/465）、3.44%(16/465)、2.80%(13/465)、1.72%(8/465)，不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。猪EST 资源中含有高频率的SSR位点，且EST-SSR 标记开发效率较高，本研究为猪EST-SSR标记的建立和进一步应用奠定了基础。
关键词： 猪；EST-SSR；重复基元
1. 前言
1.1 猪的实用价值及研究简述
猪早在7000年以前就被人类驯养，是人类最早驯化的家畜之一，且在地球上分布很广。猪不仅仅具有非常高的经济价值和研究价值，还具有丰富的营养保健价值和文化价值。
首先，猪的经济价值非常可观。例如2004年世界肉类总产量为25750万吨，其中猪肉产量为10039万吨，占了世界肉类总产量的39%[1]。其经济价值可见一斑。在我国，“猪粮安天下”充分诠释了生猪产业对国家社会、经济影响有着重大意义。猪肉是我国大多数城乡居民主要肉类消费品，在畜禽肉类产品消费中，猪肉约占65%，同时，猪肉价格在我国CPI指数权重高达6%。我国既是猪肉消费大国，也是生猪养殖大国，猪肉消费量和生猪养殖量均占世界总量的一半左右，均位居世界第一。生猪养殖业是我国畜牧业的主要组成部分，其产值约占畜牧业总产值的50%。据国家统计局数据显示：2010年生猪出栏6.67亿头，猪肉总量5070万吨，人均消费量达到37.8公斤[2]。此外，猪还可以为许多制成品提供很多的原料。例如猪皮是一种蛋白质含量很高的肉制品原料，以猪皮为原料用以加工皮花肉、皮冻、火腿等肉制品。
其次，猪的营养保健价值与文化价值也不禁让人惊叹。猪肉在人们日常生活中具有无可替代的食用营养功效，可是说它全身都是“宝”。它不仅可以补虚滋阴，而且还是养血润燥的良品之一。此外，猪肉还为人类补充丰富的必需氨基酸，微量矿物质以及维生素等，同时具有良好的保健功效。猪心对加强心肌营养，增强心肌收缩力有很大作用。猪肝可用于肝血不足，目昏眼干，夜盲等症[3]。此外，猪在我国还具有着独特的文化价值。猪从古至今是我国祭祀必备物品之一，是中国纪念和节庆的重要代表形式。哈佛人类学家詹姆斯·沃森称，如果重阳节不用猪进行祭祀，中国人的祖先会第二次极为痛苦的死去，灵魂彻底消灭。
最后，生物学研究价值也非常突出。猪也是人类生物学研究的极佳模型之一。它的基因组序列和染色体结构与人类高度同源，体型、生理学特征和疾病发展也与人类极其类似。与此同时，其窝产仔数多，繁殖速度快，克隆与转基因技术也极为成熟，拥有许多特性明确的细胞系可供利用[4] 。
畜禽类动物与人类的生产、生活息息相关，因此它们也是动物研究中重点之一。猪作为一种具有极高实用价值的畜禽动物之一，其生物学等方面的研究热潮也一直延续着！
国际上动物生物技术发展极为迅猛，畜禽动物基因组计划始于20世纪90年代初，1991年美国农业部同时资助启动了美国的猪、牛、鸡基因定位计划，即“国家动物基因组研究计划”；欧洲猪基因组计划定制于1989年，1990年正式启动；日本在1992年启动动物（猪和马）基因定位研究计划；中国也于20世纪末启动了家猪基因组计划[5]。随着基因方面研究的不断深入，研究成果也不断涌现。目前研究表明，猪的基因组与人类基因组有广泛的保守同源区域以及相似的染色体结构，于是有专家预测，猪可能是未来研究人类疾病理想的动物模型和外源器官移植的重要来源。正是由于猪重要的的经济及医学研究价值，许多关于猪的研究计划也先后被掀起。其中猪基因组的研究是研究的热点和重点[1]。
正是因为这些因素的不断积累，分子标记技术的应用研究也让人们眼前一亮。例如猪的分子标记辅助育种。同时这些应用也促进了新分子标记技术的研发，以EST为基础的SSR分子标记也以其独特的优势正吸引着众多科学研究者的眼球！
1.2 SSR信息分析简述与EST-SSR标记的优势及应用
简单重复序列（Simple sequence repeats, SSRs），是指以少数几个核苷酸（一般为2~6个）为基本单位多次串联重复的DNA序列[6]。与其他分子标记技术相比，SSR标记不仅具有孟德尔共显性遗传、操作简便、易检测、多态性好的优势，同时还具备了在基因组上分布均匀、特异性强、重复性好等长处，自20世纪90年代以来已经被遗传学家广泛应用。目前，SSR标记已经在基因定位作图、遗传多样性评价、构建基因图谱、鉴定个体及亲缘关系，标记辅助选择和数量性状位点（QTL）定位等研究领域彰显出了其巨大的应用潜力。根据序列性质不同，SSR标记主要分为基因组SSR（Genomic SSR, gSSR）和表达序列标签SSR（Expressed sequence SSR, EST-SSR）两种。
EST-SSR (表达序列标签微卫星)技术就是利用已有的EST 序列通过电子筛选鉴别SSR，然后根据SSR两端保守的侧翼序列设计引物，通过PCR 扩增基因组编码区的微卫星序列，将扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经银染后分析微卫星中核心序列重复单位数目的多态性。EST-SSR 标记来自于比较保守的转录区，具有良好的保守性，因此EST-SSR 在相关物种之间具有较高的可转移性和通用性。对于尚未进行EST 测序的物种，利用其近缘物种中已有的EST-SSR 标记或EST 序列来开发目标物种的新SSR 标记无疑会是一种行而有效的手段，这不仅加快了物种间的基因组信息转换，还为基因组研究提供了新的思路和途径。同时，EST-SSR反映了基因的编码部分，可以直接获得基因表达的信息，从而为功能基因提供“绝对”的标记，显现“真实的遗传多样性”。EST-SSR 省去了SSR 引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用了现有资源，降低了开发过程的成本，因此也正逐步成为一种发展最快、应用最广的分子标记技术。
基于EST序列开发的SSR标记，同基于基因组文库开发的SSR标记相比，有很多的优点：（1）节省资源。EST-SSR标记开发利用的是公共数据库中的EST序列，省去了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，这将节约了很多时间和测序等方面的费用，而基因组SSR分子标记的开发则必须对每个克隆个体进行筛选鉴定, 工作量大, 需消耗大量的资源, 而且效率还较低。例如在植物中已报道的阳性克隆比率约为2%~3%, 成功获得引物的机率则更低[7]；（2）高保守性和通用性。EST-SSR标记中的EST序列来自于比较保守的转录区，因此其在相关物种之间具有很高的可转移性和通用性，这使之在遗传多样性评价、遗传育种、比较作图和定位基因等研究中比基因组SSR更有价值；（3）简便快捷获取可靠基因信息。EST-SSR反映了基因的编码部分，可以直接获得基因表达的信息，为功能基因提供一个稳定的定位，可以对决定某些重要表型形状的等位基因进行直接鉴定；（4）EST-SSR高质量标记的比率要比基因组SSR高[8]。
从ESTs中开发的SSR标记已经在多种植物中有报道，如葡萄[9]、小麦[10]、玉米[11]和高粱[12]。而在动物中的报道却很少，研究主要集中于特殊生物类型。如斑马鱼[13]、鲶鱼[14]、火鸡[15]和人[16]等。近年来，我国学者也对一些常规动物进行了EST-SSR开发。如牙鲆[17]、鲤鱼[18]、山羊[19]和犬[20]。
1.3 猪EST-SSR信息分析的研究目的与意义
猪是具有很高实用价值的畜禽动物之一。然而，关于猪EST-SSR标记的相关报道却鲜有人问津。本研究对从NCBI数据库中获得的53029条猪EST序列，进行筛选、定位SSR位点，从而开发一些猪的新EST-SSR标记，这对于猪基因图谱的构建、QTL的定位和候选基因的分析、基因测序和分子标记辅助育种等研究都具有重要意义。此外，还有助于在基因层面改善其表观性状，改良品种。
2.讨论
SSR分子标记正逐步成为一种有效的、应用最广泛的分子工具，被广泛地用于遗传多样性、亲缘关系、连锁图谱构建、比较基因组学及关联分析等领域[23-25]。EST-SSR具有微卫星标记的多态性高、呈共显性遗传、数量丰富、易检测和在基因组中分布均匀等特点，又避免了传统方法中构建、筛选文库的繁琐步骤和人力物力的大量耗费；同时由于EST来源于基因的编码区，所以能在一定程度上直接、真实地标记功能基因，反映“真实的遗传多样性”；其次，由于引物设计自保守的侧翼序列，因此EST-SSR在不同物种间具有良好的通用性；相对于其他EST分子标记，EST-SSR又具有开发过程简单、成本低、基因定位准确等特点。EST-SSR标记也已相继在鲤鱼[18]、山羊[19]和犬[20]等多种动物中开发研究。研究结果表明，EST-SSR标记作为一种高效简便的分子标记，在遗传多样性评价、品种及亲缘关系的鉴定、遗传连锁图谱构建、比较基因组学研究、比较作图和新基因的定位筛选等研究方面都有着重要的用途[21]。
本研究开发了一些猪EST-SSR分子标记。从NCBI数据库中下载得到猪53029条EST序列，去除PolyA或PolyT以及冗余序列后，共得到4285条非冗余序列。在这些非冗余序列中，共含有465个SSR位点，SSR的发生频率为10.85%。EST序列的总长度为3085.10kb，从分布情况来看，平均每6.63kb就出现一个SSR即猪EST-SSR的平均距离为6.63kb，这说明猪中EST-SSR含量相对比较丰富。在去冗余之后得到4285条非冗余序列中，共发现含SSR位点的序列453条，占非冗余EST序列总数的10.57%。这个频率与植物相比，高于白菜的10.34%，并远远高于甘蔗的2.9%[26]、水稻的4.7%[27]、普通小麦的5.4%；与水产动物相比，这个频率高于牙鲆11.33%[17]，并远远高于鲤5.5%[28]。这种差异可能是物种间的真实SSR信息差异，也可能是运用MISA软件查找SSR时设定的重复次数的标准不同所致。
当四种不同碱基随机组合时，若EST-SSR数目足够大且无偏倚性，将可分别产生2、4、10、33、102和350种单、二、三、四、五、六核苷酸基本重复基元类型[29]。对猪EST-SSR的分析结果显示，各核苷酸基本重复基元都有出现，种类分别为1、4、5、6、5、3。与植物EST相对比，猪的EST分布表现了不同的特征：其一，大多数植物的EST-SSR 以三核苷酸和二核苷酸重复类型为主[30]，而猪却单核苷酸重复虽然只有一种，数量却占到了总数的79.78%，在数量上表现出明显的偏倚性。其二，重复基元的类型相对单调，下载了53029条的EST序列，重复基元却只有24种，重复类型上也呈现偏倚性。所出现这些偏倚性是猪EST-SSR的真实反映还是分析EST数量不足或者二者兼有之所造成，还需进一步研究。最终引物共合成4950条，对于检出的EST-SSR引物的可用性也进行了两方面的评价分析，其多态性分析需要做进一步的研究验证，不过凭借着高科技手段的有力支持，EST-SSR技术的高效性确实毋庸置疑，笔者对其在动物中的研究前景充满信心！
总之, 当前开发EST-SSR标记可作为基因组SSR标记的重要补充，这不仅将对于猪遗传图谱的绘制、功能基因的定位分析、分子标记辅助育种和种间亲缘关系的鉴定等研究产生积极的影响，而且还可以为其他畜禽动物的EST-SSR开发提供模板。
参考文献
[1] 陈静, 杜红丽, 张细权. 猪基因组研究进展[J]. 广东农业科学, 2007(5): 81-95.
[2] 北京首都农业集团有限公司. 2025年中国猪肉需求量将达5640万吨[Z]. 2011.3.29, http://www.52swine.com/xinwen/201103/24627.html..
[3] 猪的价值[Z]. 百度百科, 2015.5.27, http://www.chu-ying.com/show_zwh.aspx?Id=317..
[4] 史惠, 余权. 猪生物医学模型的基因组学研究进展[J]. 国外畜牧学-猪与禽, 2008 28 (3): 179-184.
[5] 兰旅涛, 董希慧, 郑国华等. 分子标记技术在现代猪育种中的应用现状与前景[J]. 江西农业学报, 2004 16 (2): 46-50.
[6] 闫秋良, 翟洪军, 刘臣. EST-SSR标记的开发及在动物研究中的应用[J]. 中国畜牧兽医, 2009,36 (7):102-105.
[7] 张增翠, 侯喜林. SSR分子标记开发策略及评价[J]. 遗传, 2004, 26 (5):763-768.
[8] 陈全求, 詹先进, 蓝家样等. EST分子标记开发研究进展[J]. 中国农学通报, 2008.9, 24(9):72-77.
[9] Scott K D, Eggler P, Seaton G, et al. Analysis of SSRs derived from grape ESTs[J]. Theor Aplied Genet, 2000, 100(5):723-726.
[10] Eujayl I, Sorrells M E, Baum M, et al. Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J]. Theor Applied Genet, 2002, 104(2-3):399-407.
[11] Kantety R V, Rota M L, Matthews D E, et al. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barly, maize, rice, sorghum and wheat[J]. Plant Mol Biol, 2002, 48(5-6):501-510.
[12] Morgante M, Hanafey M, Powell W. Microsatellites are preferentially associated with norepetitive DNA in plant genomes[J]. Hum Mol Genet, 2002, 30(2):194-200.
[13] Serapion J, Kucuktas H, Feng J, et al. Bioinformatic mining of type I microsatellites from expressed sequence tage of channel catfish (Ictalurus punctatus)[J]. Mar Biotechnol (NY), 2004,6(4):364-377.
[14] Ju Z, Wells M C, Martinez A, et al. An in silico mining for simple sequence repeats from expressed sequence tags of zebrafish, medaka, fundulus and xiphophorus[J]. In Silico Biol, 2005, 5(5-6):439-463.
[15] Dranchak P K, Chaves L D, Rowe J A, et al. Turkey microsatellite loci from an embryonic cDNA library[J]. Poult Science, 2003, 82(4):526-531.
[16] Haddad L A, Parra F C, Pena S D. Characterization and mapping of four novel human expressed polymorphic trinucleotide microsatellites[J]. Gene, 1998, 223(1-2):369-374.
[17] 刘奕, 陈伟兴, 周丹等. 基于公共数据库牙鲆EST-SSR的开发及特征分析[J]. 海洋渔业, 2013. 5, 35(2): 137-142.
[18] 顾颖, 曹顶臣, 张研等. 鲤与生长性状相关的EST-SSRs标记筛选[J]. 中国水产科学, 2009(1): 15-22.
[19] 赵传志, 李爱芹, 李长生等. 山羊EST资源的SSR分析[J]. 山东农业科学, 2009,(6): 6-9.
[20] 刘清神. DNA分子标记及其在犬中的研究进展[J]. 中国工作犬业, 2008(2):11-14.
[21] 张琼, 刘小林, 李喜莲等. EST-SSE分子标记在水生动物遗传研究中的应用[J]. 《水产科学》 2010 29(5): 302-306.
[22] 许忠能. 《生物信息学》[M]. 清华大学出版社2008 9第1版: 291.
[23] McCouch S R, Chen X, Panaud O, et al. Microsatellite marker development, mapping and application in rice genetics and breeding [J]. Plant Molecular Biology, 1997, 35: 89-99.
[24] Cardle L, Ramsay L, Milbourne D, et al. Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants [J]. Genetics, 2000, 156:847-854.
[25] Morgante M, Hanafey M, Powell W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes [J]. Nature Genetics, 2002, 30: 194-200.
[26] Cordeiro G M, Casu R, McIntyre C L, et al. Microsatellite markers from sugarcane (Saccharum spp. ) ESTs cross transferable to erianthus and sorghum [J]. Plant Sciences, 2001, 160( 6): 1115-1123.
[27] Kantety RV, La Rota M, Matthews D E, et al. Data mining for smiple sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat [J]. Plant Molecular Biology, 2002, 48( 5-6): 501-510.
[28] WANG D, LIAO X L, CHENG L, et a1. Development of novel EST—SSR markers in common carp by data mining from public EST sequences [J]. Aquaculture, 2007,(271):558—574.
[29] Rota L R, Kantety R V, Yu, J K. Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice, wheat, and barley [J]. BMC Genomics 2005(6):23.
[30] 李永强, 李宏伟, 高丽峰等. 基于表达序列标签的微卫星标记(EST-SSR)研究进[J]. 植物遗传资源学报, 2004, 5(1): 91-95.
目 录
1. 前言 1
1.1 猪的实用价值及研究简述 1
1.2 SSR信息分析简述与EST-SSR标记的优势及应用 2
1.3 猪EST-SSR信息分析的研究目的与意义 3
2. 材料与方法 5
2.1 猪EST序列的获得 5
2.2 EST前处理 5
2.3去冗余与聚类 5
2.4 SSR的筛选定位 5
2.5 EST-SSR引物设计与合成 6
3. 结果与分析 7
3.1 猪EST-SSR的分布频率 7
3.2 猪EST-SSR的特性 8
3.2.1 猪4285条非冗余序列中不同SSR出现的情况 8
3.2.2 EST-SSR重复单元的特点和基元长度 11
3.2.3 猪EST-SSR的可用性评价 12
4. 讨论 13
致谢 15
参考文献 17
