毕业设计我帮你

1.病例资料

   黄某某，女，36岁，已婚。由于身体虚弱，肝痛和轻度发烧，于2019年10月29日对该患者进行了随访。于2019年10月29日10:56就诊我院住院治疗，入院查体：心脏和肺没有异常，主要是在腹部与肝脏有轻微的叩击疼痛，移动性浊音（+）;体温：37.9℃，脉搏：88次/min，呼吸：26次/min，血压：110/70 mmhg。实验室试验：生化试验：ALT: 255 u/L,  AST: 168 u/L,  TBIL: 12.1umol/L,  GGT: 80U/L,  ALP: 91U/L；免疫：表面抗原/抗体：（+）。为慢性乙型肝炎的第一次临床诊断。

2.检验方法

2.1 PCR-荧光探针法

2.1.1实验目的

    ―规范乙型肝炎病毒核酸检测项目的流程，检测受检者乙型肝炎病毒核酸含量，为乙型肝炎辅助判断、药物疗效监控、治疗方法的选择提供依据和指导。

2.1.2实验原理

    HBV通过核酸减少剂迅速分解和释放血清或血浆样本HBV-DNA，作用于目标区域。开发一些特殊的引物和一些特殊的荧光探测器，对PCR反应液在PCR荧光仪器上的反应配合一致；在HBV-DNA定量分析中，可以通过实时使用荧光定量PCR技术来实现荧光信号的变化。试剂盒内还含有内标物，用于监控整个核酸提取的过程，减少产生假阳性和假阴性结果的可能性。根据核酸检测剂提供用于临床处理PCR样品的核酸试剂，将提取的核酸添加到反应管中，通过PCR仪扩大，检测到荧光信号，软件系统自动识别实时放大曲线，作为对未知样品的阈值（CT）。

2.1.3标本采集与运输

    ①―血清：采用一次性无菌注射器，在空腹状态下抽取病人的血液，并将2 mL静脉血注入无菌和无抗凝剂的采集管中，在22~25℃ 30 min的状态下静置，冷却凝固后使用离心机1500rpm的速度离心5 min；然后，吸上层血清出来，重新转移到消毒的离心管1.5 mL中。

    ② ―血浆：采用一次性无菌注射器，在空腹状态下抽取病人的血液。并注入的含有EDTA和枸橼酸钠的试管中。轻轻颠倒混匀5~10次，血液必须与抗凝血剂完全混合。5 ~10 min过后，血浆分离转移至1.5 ml灭菌离心管。

    ③标本保存及运输：同时立即测试，存放在-20℃冰箱，6个月内保质期下，备用。样品在0℃的冰壶中运输。

2.1.4实验步骤

①PCR试剂制备（试剂制备区）

    a.单管单人份：直接使用HBV-PCR反应管。

    b.份大包装: 反应液配制表如下：

组分 HBV反应液 Taq酶 总体积

用量/人份 27ul 3ul 30ul

②DNA提取（样品制备区）

     a.样本处理：首先，同时处理用于测试样品的定量参考物、HBV强阳性质控物、HBV阳性对照和HBV临界阳性对照、DNA提取液和内标液。

     b.打开恒温器，调节恒温器的自动升温。将准备好的放入生物安全柜内，取200 ul样品，添加到450 ul提取液I用振荡器晃动5 s,瞬间离心数秒（离心管的编号方向都要朝管口开启的方向）。100℃恒温处理10±1min；12000rpm离心5 min，上清液即为DNA模板。

③将加样（样品制备区）

    添加上述HBV反应管中，并在提取后的HBV反应管中还添加提取样品核酸、HBV阴性质量控制、HBV强阳性质量控制、HBV临界值质量控制和阳性定量参考品，每个上清液20ul作为定量参照物（小心吸取上清液，不要触碰底部沉淀）。盖紧反应管，8000rpm离心数秒，转移至扩增检测区。

④PCR扩增（扩增和产物分析区）

ABI prism 7500仪器设置（严格按照仪器说明书操作）

    a.从传递窗中取出PCR反应管放入仪器样品槽内，按照与样品相对应顺序设置阴阳质量控制（NTC）、阳性指控和未知样品（Unknow），打开电脑显示有“Setup”窗口， 并在“Sample Name”栏中输入所需的样本名字；探针检测模式设置为：Reporter Dyel:  FAM,  Quencher Dyel: none; Reporter Dye2: VIC, Quencher Dye2: none; Passive Reference: Rox。

    b.打开instrument窗口，并设置如下循环条件：       

93℃  2 min

93℃  45 s→55℃   60 s→10个循环。

93℃  30 s→55℃   45 s→30个循环。

保存文件，运行。

2.1.5注意事项

    ①尽管套件中的质量控制产品等组件已通过HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等的测试，但到目前为止，尚无用于确保绝对安全性测试，但也被认为是潜在的污染源。

    ②在实验期间，操作员必须穿工作服、戴手套、口罩等等，一旦接触标本后就必须及时更换。各区物品（包括各区衣服、废液瓶）也必须专用，不可以混用，单一流向进行。所使用耗材应在灭菌后应使用一次,并且每个阶段和每个阶段的耗材不能交叉使用。

    ③样品必须在生物安全柜内进行处理，在使用测试以避免细胞再次退化之前，必须完全解冻，避免反复多次使细胞破碎。下一步实验之后，如没有继续实验样品保存在-20℃下待用（24h）。

    ④如果交叉污染在样品处理过程中没有得到很好的控制，可能会出现错误的阳性反应。同时，应对每次的实验进行质量控制。

    ⑤实验完成后，用10%的次氯酸钠和75%的酒精清洗工作台和加样枪，以及其他暴露在样品中的物体都要被丢弃在生物危害容器里。然后，开启紫外线照射20-30 min。最后，脱下手套后洗手，然后脱下工作服用消毒剂洗手。

2.1.6结果分析

乙型肝炎病毒核酸检测（报告单附后）

图1.1

刚入院核酸检查报告

 

 

图1.2

经药物治疗二个月后

 

 

    患者刚入院的之前前两个月（2019.10.29）DNA检测结果为8.79 E7 IU/ml，经过两个月治疗，本次入院（2019.12.4）后通过采用乙型肝炎病毒核酸检测（PCR-荧光探针法），其DNA检测结果为8.28 E4 IU/ml，表明核酸含量有下降，病情得到缓解。随后，我们与其主诊医生进行沟通，了解到患者在此期间进行了两到三个疗程的抗病毒治疗，核酸明显下降，病情也得到了有效改善。此外，她的肝功能相比之前也得到了恢复。

3.确诊依据

    根据患者入院的精神状态，全身乏力，肝部疼痛，还伴有发热现象的临床症状，通过医院体查、生化以及免疫的各项检查。最后，利用DNA检测乙肝病毒的技术手法，检查发现患者的乙肝病毒DNA定量检测为8.79 E7 IU/mL。乙肝浓度越高，复制率越活跃，既可作为慢性乙型肝炎的确诊依据又可以根据其浓度变化作为乙型肝炎疗效观察的一个可靠指标。

4.疗效观察

   乙肝抗病毒治疗是一个漫长而复杂的过程。可以对病毒进行类型分析、变异分析、药物评估和监控。病人服用恩替卡韦治疗可以强效抑制病毒复制，肝脏活动的减轻，损害减少，则需要定期检测，积极地监测指标变化、控制疾病和疗效监控。从而，降低了病毒的抗药性。

5.概述

    乙型肝炎是全球流行的一种传染病。特点：这种疾病相对缓慢，在亚临床和慢性类型中更为常见。主要临床表现：身体虚弱，对食物的乏味和恶心，以及肝脏疼痛等症状。病人的消化系统有明显的严重问题，伴随症状有：肝硬化、肝源性糖尿病、以及肝炎后的高胆红素血症等。这种疾病是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的，它是一种基于多器官损伤的传染病。因此，隐形感染后严重威胁人类生活健康。

6.结论

    通过这次毕业设计，对乙肝病毒DNA有些直观地理解，乙型肝炎病毒复制和存在的数量以及对患者病情和感染评估产生了积极影响；它可以直接反映肝炎在人体内复制的状态，以及反映人体免疫系统水平的病毒复制活性；此外，还可协助于医生的诊断和使用药物的建议，以确定哪些抗生素适合患者治疗用药时间以及对其他药物进行联合临床治疗的需要。因此，乙肝病毒DNA分析非常重要，DNA检测更在治疗和监控乙型肝炎方面也是非常重要。  

    结束语：首先，在我最后的大学学习阶段非常非常  感谢老师的指导。一开始我真的非常惆怅，不知如何下笔，幸好有辅导老师耐心地帮助我、指导我，还帮我解决了所有的问题，同时还在这过程中帮我查询了许多相关文献。其次，也给了我信心继续写下去的勇气，终于通过我不懈努力修改完成了一篇合格的毕业设计。

7.参考文献

    [1]陈贤坤，吴翠云.HBsAg与HBV DNA定量在慢性乙型肝炎患者不同病程阶段中的应用价值[J].检验医学与临床,2019,16(13):1829-1832.

    [2]戴涛.HBV-DNA定量与乙肝血清学标志物定量联合检测乙肝病毒感染的效果分析[J].实用医药临床杂志,2019,(12):68.

    [3]伦明.HBV-DNA定量检测与乙肝感染血清标志物结果分析[J].临床药学文献杂志(电子版)，2019,6（78）:63.

    [4]王杰，于广鑫，鲁凤民.高灵敏HBV-DNA检测的临床意义[J].分子诊断与治疗杂志，2019，11（5）:343-344.

    [5]张艳奇.实时荧光定量PCR法在乙肝病毒DNA及血清标志物检测中的应用价值[J].黑龙江医药,2019(1):204-205.

    [6]冯磊.双靶高灵敏度HBVDNA检测技术，在HBeAg阴性患临床诊断中的应用[J].分子诊断与治疗杂志,2019,11(5):369-373.