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1. 广州管圆线虫病的概述：

   广州管圆线虫病是我国较常见的一种蠕虫蚴移行症，病原体为广州管圆线虫幼虫或成虫早期（性未成熟）阶段。临床上较常发生内脏，尤其是中枢神经系统感染，导致发热，头痛，呕吐，抽搐，昏迷等嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎或脑膜炎。该病为食源性寄生虫病的一种，又名嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎。该病主要是因进食了含有广州管圆线虫幼虫的生或半生的螺肉而感染。如今已被列为国家新发传染病。这是一种以病原名称命名的疾病。

2. 病例导入

   患者基本情况，男，34岁。因食用凉拌福寿螺肉数日后感觉双肩疼痛，颈部僵硬，随后出现双侧肋部及颈部皮肤感觉异常，有刺痛感。3周后，该患者活动，翻身，走路时感到头痛加重，伴恶心，到医院就诊，查体：体温38.1℃，p73次/min，BP138/90mmHg，血常规检查白细胞6.1×10 9/L，嗜酸粒细胞百分比20.6%，胸部脑部ct检查无明显异常，临床诊断为嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎（即广州管圆线虫）待查。经检疫福寿螺样品，螺肉中检出广州管圆线虫第3期幼虫，该患者确诊为嗜酸细胞增多性脑膜炎。

3. 检验方案 

   直接涂片法、脑脊液检查，免疫学检查

3.1直接涂片法

3.1.1实验原理

   通过大便，脑脊液直接涂片，在显微镜下镜检观察有无寄生虫感染，然后墨汁染色和革兰氏染色查看有无细菌真菌感染。

3.1.2标本采集与处理

   医护人员佩戴好手套、防护服、口罩，患者取侧卧位，由医护人员进行彻底的消毒，消毒以穿刺部位为中心从内圈往外圈旋转消毒，消毒工作完成后立即开始腰椎穿刺，期间必须严格控制无菌环境，避免外物接触到伤口附近，腰椎穿刺成功后需马上测定脑脊液压力并且记录下来。再取脑脊液标本于无菌试管中。标本应取3管，每一管取两毫升左右分别用于细菌学检测，细胞形态学检测免疫组化。取大便进行镜检。

3.1.3实验材料

   显微镜、盖玻片、载玻片、加样枪、无菌枪头、玻璃试管、无菌吸管、计数板、革兰氏染色剂、 潘氏试剂、墨汁、棉球、医用酒精、洗耳球等

3.1.4实验步骤

   先观察脑脊液的颜色，是否浑浊，有没有异物，并分别记录好，取出计数板，拿蘸有酒精的棉球，擦拭干净，然后打开显微镜调整好位置，观察计数板有没有污染，用干净吸管吸取脑脊液冲池，放在显微镜下。先用低倍镜找视野，浏览一下所有区域，然后转到高倍镜，进行镜检，开始细胞计数。计数完成后，在玻璃试管中加入2ml的潘氏试剂，用吸管吸取三至五滴脑脊液滴入试管中，可在黑色背景下观察有无白色絮状物产生，如果没有就是阴性的，如果有白色絮状物，就是阳性的结果，表示脑脊液中含有球蛋白。革兰氏染色时先要进行固定，用草酸铵结晶紫染色液染1分钟，液面覆盖整个标本，然后用蒸馏水冲洗，然后加碘液再染1分钟，水冲洗待干后用洗耳球吹走多余水分加快水分蒸发，用酒精脱色后水洗然后用洗耳球吹干多余水分后，加潘红染色液染色1分钟，最后用蒸馏水冲洗，待干燥后进行镜检。墨汁染色时先要将标本在离心机里以3000r/min速度离心5-10分钟，用蘸有酒精的棉球擦拭加样枪进行消毒，再用无菌枪头取管内沉淀涂抹在干净的载玻片上以适当的比例加墨汁混匀，在盖上盖玻片，静置三分钟后用显微镜观察有无新生隐球菌。

3.1.5注意事项

   穿刺用针头宜粗不宜细，一般用7号或9号穿刺针，脑脊液离心后应立即进行检查，标本要在无菌环境下进行实验，脑脊液要及时送检，革兰氏染色时间，水量的大小和冲水的角度得掌握得当，所有实验器材都得保持无菌的干净的不能有所污染。

3.1.6实验结果

   脑脊液外观呈微浊乳白色状态，白细胞计数增多，蛋白增高，未发现有寄生虫和虫卵，革兰氏染色和墨汁染色未见真菌和细菌，镜检可见大量嗜酸粒细胞，分类计数超过10%。

3.2免疫学检查

3.2.1双抗体夹心隐联免疫吸附试验实验原理

   采用广州管圆线电成虫粗抗原多克需抗体.运用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测广州管圆线虫病患者血清循环抗原。

3.2.1.1抗原制备

   从人工感染SD大鼠心脏.肺脏分离广州管圆线虫成虫,生理盐水漂洗后冰冻干娛,加入蛋白酶抑制剂，研磨成粉,冷丙酮脱脂8次，超声粉碎(冰浴,3min/次,共5次),反复冻融，4℃,30000r/min离心2min,取出上清液,用Lowry法测定蛋白质含量，一20℃保存备用。

3.2.1.2多克隆抗体制备

   取粗抗原溶解于生理盐水中，配置浓度为2μg/mL.,加入等体积的福氏完全佐剂,皮下免疫BALB/c雌性小鼠,每只0.5mL,2周后加强免疫一次，免疫方式为粗抗原加福氏不完全佐剂，皮下免疫。末次免疫1个月后,断尾取血，用粗抗原检测制备抗体的效价_ 200)口保存备用。

3.2.1.3检测方法

   用pH9.6碳酸盐缓冲液将纯化单抗稀释成10μg/mL.每孔100μL,4℃包被12h弃除液体,用0.05%吐温20-PBS洗涤3次,每孔加入封闭液(5%小牛血清)100 μL.37℃孵育1h,0.05%吐温20-PBS洗除3次每孔加入 100μL待测血清,37℃孵育45min,0.05%吐温20-PBS洗涤5次.每孔加入100μL酶标单抗（1：1600）37℃孵育45min，0.05%吐温20-PBS洗涤5次每孔加入100μL底物37℃避光显色20min，每孔加入100μL 2mol/L，H2SO4终止显色，酶标仪读数。

3.2.1.4结果判定

   以阴性对照血清OD值均值加3个标准差为正常值上限，大于此值为阳性。

3.2.2酶联免疫吸附试验实验原理

   采用广州管圆线虫第4期幼虫可溶性抗原检测患者血清或脑脊液中特异性抗体。

3.2.2.1广州管圆线虫第4期幼虫粗抗原制备

   用人工消化法从福寿螺或褐云玛瑙螺体内分离广州管圆线虫第三期幼虫:将螺体组织剪碎后加入人工消化液(盐酸7 mL,胃蛋白酶2 g,生理盐水993 mL),置37心恒温箱内,消化3 h~4 h.消化沉淀物用铜筛过滤,滤液沉淀水洗2次,弃除上清液。沉淀物置于显微镜下观察,用毛细吸管吸取广州管圆线虫第三期幼虫,放置于含生理盐水的玻璃皿中将第三期幼虫腹腔接种SD大鼠,10 d后解剖大鼠。从其脑组织中分离出广州管圆线虫第四期幼虫。用无菌生理盐水冲洗活虫体3~4次，根据虫体压积加入约10倍量的0.01%硫柳汞生理盐水,匀浆器研磨,交替冻融6次。6d后用300 mA超声处理4次,每次5 min,然后经10 000 r/min(4℃)离心30 min。取上清液即为可溶性抗原液,测蛋白含量,贮存于一20℃冰箱备用

3.2.2.2实验方法

   以pH9.6碳酸盐缓冲液(PBS)稀释上述制备抗原,包被96孔PVC(聚苯乙烯)酶标板,每孔50μL,孵育2h后置于4℃湿盒内过夜甩去孔内抗原溶液，PBS-T0.5%吐温)洗涤3次，晾干,每孔加封闭液(5%小牛血清)200μL37℃封闭孵育2h。加入用PBS按1 : 200稀释的待测血清50μL37摄氏度孵育1 h。PBS-T洗涤3次后每孔加入1 : 100稀释的酶结合物[辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG]50 μL,37℃孵育1 h,洗涤3次,晾干。每孔加入TMB溶液[用3,3',5,5*-四甲基联苯胺(TMB)配制，临用时按每10mL底物液加3%H2O2 0.1 mL]50 μL,37 ℃，15 min,加入1 mol/L的H2SO,终止反应。

3.2.2.3结果判定

   在酶标仪 上以450/620 nm双波长读取OD值,P/N>2. 0为阳性(P表示待测样本OD值,N表示阴性对照平均OD值)。

3.2.3.1间接荧光抗体试验实验原理

   采用广州管圆线虫第三期幼虫可溶性抗原检测广州管圆线虫病患者血清抗体。

3.2.3.2广州管圆线虫幼虫抗原制备用

   人工消化法从福寿螺或褐云玛瑙螺体内分离广州管圆线虫第三期幼虫,冰冻包埋,切成4μm厚切片，贴附手0.5%明胶处理的玻片备用。

3.2.3.3检测方法

   取患者血液2 mL,放置30 min,1500 r/min离心5 min分离血清待用。将待测血清1: 19稀释，即取20风L待测血清加入480pμL PBS（0.01 mmol/L、pH8.0的磷酸盐缓冲液）用pH7.4的PBS冲洗切片1~2次后,加100μL稀释血清,置37℃湿盒30 min.冲洗3次，再加入以异硫氰酸标记的羊抗IgG置37℃湿盒30min。冲洗、风干后置荧光显微镜下观察。

3.2.3.4结果判定

   虫体体壁肌肉内缘与内脏外缘有黄绿色荧光判定为阳性结果，否则为阴性结果。

4.确诊依据： 

   该患者自述食用凉拌福寿螺，在调查结果中显示福寿螺中含有广州管圆线虫虫卵幼虫，血细胞分类计数的检查结果中显示嗜酸性粒细胞数升高，提示有感染寄生虫的可能，脑脊液中嗜酸性粒细胞显著升高，蛋白含量也增高而脑脊液中的真菌细菌培养均为阴性，所以排除细菌真菌感染，所以更加怀疑寄生虫感染的可能性，考虑到脑脊液对寄生虫的检出率有限，所以采用了特异性抗体检测的方法，根据实验结果结合患者的症状表现为皮肤疼痛、头疼，恶心等症状，最终检测的结果怀疑为广州管圆线虫感染。

5.结论

   广州管圆线虫是一种食源性寄生虫病。它可以通过食入生或半生的螺类、蛞蝓、青蛙、蜗牛、鱼、虾、蟹、蛇等而感染，可能含广州管圆线虫的动物高达50余种。此外，生吃被幼虫污染的瓜果、蔬菜，饮用被幼虫污染的水也可能感染。广州管圆线虫具有嗜神经性，侵入人体后常侵犯中枢神经系统，引起脑炎和脑膜炎。病变常累及大脑、脑膜、小脑、脑干、脊髓等处，也可侵犯眼睛和鼻子，成虫可损害肺和心脏。患者常出现剧烈头痛、颈项强直、躯体疼痛、呕吐、低中度发热（严重时高热）。这个病潜伏期3～36天，平均16天。感染初期，病人可出现呕吐、腹痛、腹泻，或立即出现皮肤皮疹等前驱症状，一般持续数天后消退。多数病人没有上述前驱症状，急性起病。如果及时得到治疗，这个病预后良好，若治疗不及时或不规范，也可使人致死或致残。应该注意个人卫生，勤剪指甲、勤洗澡、衣服被单勤换；养成饭前、便后洗手的习惯；不玩青蛙、蝌蚪、蜗牛等“野生小宠物”不吃生的或未经彻底煮熟的肉类（鱼、虾、蟹、螺）或水生植物（荸荠、茭白、菱角等）；改变吃醉虾、卤河蟹、凉拌河蟹、腌蟹、醉蟹、喇蛄酱、喇蛄豆腐、生鱼片、鱼生粥、吞蛇胆、饮蛇（鳖）血、烧烤和涮锅等不良饮食习惯；不喝生水，不吃生的蔬菜和不洁的瓜果；生熟器皿、刀具、砧板分开；不用盛过生鲜品的器皿盛放其它直接入口食品；加工过生鲜的刀具及砧板必须清洗消毒后方可再使用。如果发现疑似感染症状，应该及时去医院就诊，不能懈怠。

5.参考文献

[1]梁韶晖,潘长旺,谭峰，黄慧聪,邢文鸾等.双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫循环抗原的研究.中国人兽共患病杂志.2005,21:880-882.

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[3]王小同,李方去,黄汉津,李向阳等.酶联免疫吸附试验测定广州管圆线虫病患者血清抗体的临床意义.中国神经免疫学和神经病学杂志.1999 ,6:128-130

[4]王小同,李方去,黄汉津,李向阳等.酶联免疫吸附试验测定广州管圆线虫病患者血清抗体的临床意义.中国神经免疫学和神经病学杂志.1999 ,6:128-130

[5]许隆祺,余森海 ,徐淑惠.中国人体寄生虫分布与危害.北京:人民卫生出版社.2000:928

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