苏ICP备112451047180号-6
摘要：碱性蛋白酶作为一种天然的高分子催化剂, 因其具有极高的选择性、反应条件温和、无污染等诸多优点, 使其在食品加工、医药等产业中有着极为广阔的应用前景。然而, 游离酶的不稳定和容易变性等缺点,限制了其在工业化生产中的应用, 此外, 从反应体系中分离和提纯酶也增加了其作为催化剂的成本，固定化酶技术正是在此条件下得以提出和发展的。本文综述了碱性蛋白酶在以壳聚糖为载体的条件下戊二醛溶液浓度、温度、时间、PH值、给酶量因素在固定化过程中得影响，探索固定化碱性蛋白酶的最优方法及最佳工艺路线，并对固定化碱性蛋白酶的性质评定。
关键词：碱性蛋白酶；壳聚糖；壳聚糖；最优；工艺路线；性质评定
碱性蛋白酶（Alkaline protease）是一类最适pH偏碱性、适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的蛋白酶，最早发现于猪胰脏中。1945年瑞士Dr.Jaag等人在地衣芽孢杆菌中发现了这类酶。碱性蛋白酶是一类非常重要的工业用酶。Keay按不同pH对蛋白酶作用于酪素的活性曲线，酯酶对蛋白酶活力的比值，免疫学分析中有无交叉反应，以及蛋白酶的氨基酸组成和序列差异，将其分为两种类型：A型为Carlsberg型蛋白酶，B型为Novo型蛋白酶。碱性蛋白酶需要有金属离子的激活， 必须的金属离子有Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等。Ca2+对碱性蛋白酶有稳定作用。碱性蛋白酶作用位点要求在水解点羧基侧具有芳香族或疏水性氨基酸，它比中性蛋白酶水解能力更大而还且具有一定的酯酶活力。
1.碱性蛋白酶的主要来源
广泛存在于动、植物及微生物中，微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，与动、植物来源的碱性蛋白酶相比，除了具有动植物蛋白酶所具有的全部特性外，还具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、产量高、菌体易于培养、高产菌株选育简单、快速、适于大规模工业化生产等优点。因此，微生物碱性蛋白酶的研究一直为人们所关注。
2.壳聚糖简介
由于壳聚糖及其衍生物对蛋白质具有较高的亲合性，安全无毒，廉价易得，是理想的固定化载体。壳聚糖属含氨基的均态直链多糖衍生物，由甲壳素经脱乙酰化反应而得到的一种生物高分子，化学名为(1,4)-2-氨基-2-脱氧- β-D-葡聚糖。是天然多糖中唯一的碱性多糖，也是少数具有荷电性的天然产物之一。它具有许多特殊的物理、化学性质和生理功能，其分子链中通常含有2- 乙酰氨基葡聚糖和2- 氨基葡聚糖两种结构单元，两者的比例随脱乙酞化程度的不同而不同。壳聚糖的分子结构式为：
图1 壳聚糖结构图
其氨基的存在，一方面对蛋白质有较高的固定化效率；另一方面，又可螯合金属离子，使酶免受金属离子的抑制；同时它具有多孔结构，适于底物为粘稠溶液或大分子物质的酶的固定化。
3.碱性蛋白酶固定化的研究现状
关于碱性蛋白酶的固定化载体及方法的研究已有很多。
李民勤，闭春宇，徐慧显，何炳林（南开大学高分子化学研究所）关于α，ω─二羧基聚乙二醇磁性毫微粒固定化碱性蛋白酶的研究 。用平均直径为３８４纳米的α，ω─二羧基聚乙二醇磁性毫微粒．碱性蛋白酶通过吸附交联法被固定于磁性毫微粒．研究了制备过程中的吸附时间、给酶量、戊二醛浓度、ｐＨ和离子强度对磁性固定化酶活力及酶固定化率的影响．比较了磁性蛋白酶磁性固定化酶与自由酶的酶学性质。
侯利霞, 相朝清, 王金水, 赵舒畅（河南工业大学粮油食品学院）用多孔壳聚糖微球吸附和戊二醛交联的方法, 将碱性蛋白酶固定于壳聚糖上. 在pH、加酶量、温度、戊二醛体积分数和固定化时间5个单因素试验的基础上, 利用响应面分析法对固定化碱性蛋白酶的工艺条件进行了优化。
林松毅，宋龙凤，刘静波，于志鹏（营养与功能食品研究室）利用乳化交联法制得壳聚糖微球并用于碱性蛋白酶的固定，借助正交试验设计优化酶固定化条件，条件表明：常温条件下，戊二醛浓度为1%，以给酶量240U/g载体加酶，在PH10缓冲液中，交联20h时，固定化碱性蛋白酶的活力和活力回收率可达到119U/g和49.6%；固定化碱性蛋白酶耐热性较游离碱性蛋白酶较强，4℃的半衰期可达14d。
4.碱性蛋白酶在食品工业中的应用
有数据显示，全世界工业用酶每年销售额大约为1 亿美元，在所有的工业用酶制剂中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右。碱性蛋白酶在食品工业、洗涤行业及生物技术等领域中有着广泛的用途。
4.1 利用碱性蛋白酶提取大米水解蛋白
大米蛋白以其合理的氨基酸组成，较高的生物利用率及特有的低过敏性等特点被公认为优质植物蛋白。与传统的碱提酸沉法相比，酶法提取是利用蛋白酶对大米蛋白的降解和修饰作用，使其变成可溶性的肽而被提取出来。酶法提取反应条件温和，蛋白质多肽链可水解为短肽链，提高了蛋白质的溶解性，同时其反应的液固比小，提高了提取液中的固形物含量，降低了用于除去提取液水分的能量消耗，为工业生产创造了有利条件。
4.2 利用碱性蛋白酶水解血红蛋白
血液中含有丰富的营养物质，尤其是蛋白质，含量在18%左右，但是由于血液中2/3 的蛋白质存在于血细胞中，是血红蛋白，它的消化吸收利用率很低，所以在食品中的利用较少，废弃较多。近年来，由于酶解技术的迅速发展，用酶水解血红蛋白以提高其利用率的研究也越来越多，可供选择水解血红蛋白的酶也有多种。研究发现，碱性蛋白酶能水解血红细胞，提高蛋白质利用率，其水解的最适pH 值为8.21，最适温度为65 ℃。
4.3 碱性蛋白酶在制作面包过程中的应用
面粉是面包制作过程的主要原料。它含有不溶解的谷蛋白，这决定了面包的质量。通过碱性蛋白酶可以通过限制性降解来修饰小麦谷蛋白。酶处理的面团可以增加其韧性和机械强度从而增加其应用范围。过量使用蛋白酶可以减少面团的混合时间和增加面包的产量。使用细菌蛋白酶可以增加面团的延展性。
5.用壳聚糖作载体固定碱性蛋白酶需解决的问题
克服游离碱性蛋白酶的不稳定和容易变性等缺点,将其固定化。以壳聚糖为载体，用活化的载体与戊二醛交联制备固定化酶，并考察戊二醛浓度、时间、PH、温度、给酶量对酶稳定性、活力、回收率的影响，得出最优比，进而得到工艺路线。用多孔壳聚糖微球吸附和戊二醛交联的方法, 将碱性蛋白酶固定于壳聚糖上，需解决戊二醛直接与载体上酰胺基反应降低载体上自由醛基含量导致联酶量低的问题。
6.前景的展望
壳聚糖固定化酶技术虽然得到了很大的发展, 但仍有广阔的发展前景。各种生物大分子, 如凝血因子、生长因子、蛋白质、多肽等在医学特别是战时急救中促进伤口愈合、细胞生长、止血等方面有着重要的用途。因为这些物质的不稳定性, 平常的应用和保存条件十分苛刻, 战时急救的条件更不能满足其使用要求, 需要发展适宜的载体将生物因子固定,增加其稳定性和可贮存性, 保持各因子的活性。这方面壳聚糖与其衍生物载体有着广泛的应用前景。随着壳聚糖基载体、各种固定化方法的发展, 预计在不久的将来, 固定化酶会得到广泛的应用, 研究必将更加深入。
7. 主要材料与方法
7.1 材料与仪器
壳聚糖微球 戊二醛溶液 碱性蛋白酶
BX41 系统显微镜 奥林巴斯有限公司；HH-S 数显恒温水浴锅 常州市国立试验设备研究所；HJ-6 型多头磁力加热搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；ZD-2 型精密自动电位滴定仪 上海虹益仪器仪表有限公司；MILLIPORE 牌超纯水机 美国密理博公司；752PC 型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；AG204 型电子天平 瑞士Metter-Toledo 公司；超声波宁波新芝生物股份有限公司；CR20B2 型高速冷冻离心机 日本日立公司；HZQ-X100 型震荡恒温培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；CXG-1 电脑恒温层析柜 上海青浦沪西仪器厂。
7.2 实验方案
（1）壳聚糖微球的制备
用一定体积分数的醋酸溶液将壳聚糖完全溶解得壳聚糖酸性溶胶，然后在搅拌条件下将壳聚糖酸性溶胶滴入分散介质液体石蜡中，待溶胶均匀分散后，滴入浓度不低于25%的戊二醛溶液，搅拌10～20min,再用碱调整PH值在9～10，水浴保温3h，静置冷却后，弃去上层油层，先加入石油醚与多余的分散介质互溶弃去上层，然后用无水乙醇抽洗固形物，至分散介质完全洗净，真空干燥，过80目筛，用蒸馏水抽洗除去石油醚，无水乙醇，并真空干燥，既得酶固定化载体——壳聚糖微球。
（2）戊二醛溶液浓度对酶固定化效果的影响
4℃，pH10 的缓冲溶液条件下，分别考察戊二醛体积分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5% 时，将酶固定12h 对固定化酶活性的影响。
（3）固定化温度对酶固定化效果的影响
称取活化的壳聚糖微球，加入浓度为1% 的戊二醛，一定浓度的pH10 的酶液分别于4、12、20、30、40℃下固定12h 后抽干，即得固定化碱性蛋白酶，测其相对活力。
（4）固定时间对固定化效果的影响
当戊二醛浓度选择在1%，在室温下分别固定处理pH10 的碱性蛋白酶4 、9 、14、19、24h，测其相对活力。
(5)pH 值对酶固定化效果的影响
用浓度为1% 的戊二醛处理活化的壳聚糖微球，然后在常温下分别加入pH 值为7、8、9、10、11 的一定浓度的碱性蛋白酶，固定20h 后，即得固定化碱性蛋白酶，分别测其活力。
(6)给酶量对酶固定化效果的影响
分别称取1g 经1% 浓度的戊二醛处理过的活化壳聚糖微球，分别加入60、120、180、240、300U 活力的pH10 的碱性蛋白酶液，于常温下固定20h，测定固定化酶的活力。
（7）酶固定化条件的正交试验
在以上单因素试验所得到的较优水平的条件下，再左右各选两个水平，构成这一因素的三个水平。由于固定化时间对酶的固定化活力的影响，在一定的较长时间范围内总是有利的，因此，正交试验不把时间作为其中的一个因素；正交试验考察的分别是戊二醛的浓度、固定化温度、缓冲液的pH 值、给酶量这四个因素，同时以固定化酶的活力值及其活力回收率作为试验的两个考察指标。
（8）固定化碱性蛋白酶的性质评定结果
①固定化碱性蛋白酶的最适温度
在不同温度下，测定游离酶和固定化酶对底物酪蛋白的水解能力。分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃。
②固定化碱性蛋白酶的最适pH 值
在不同pH 值的0.1mo1/L 磷酸盐缓冲溶液中测定固定化酶和游离酶活力。PH值分别为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0 。
8.固定化碱性蛋白酶活力的测定
①固定化碱性蛋白酶活力的测定：取一定质量的固定化酶(保证最后吸光度在0.15～0.6 之间)，恒温干燥，加入2ml pH10 磷酸缓冲液，与1ml 2% 干酪素水溶液在40℃恒温振荡器内反应10min，在680nm 波长下测定吸光度。
②溶液酶活力单位( U ) 定义为：在测定条件下，每1min 在680nm 波长下，每增加0.001 个光吸收单位所需酶量为1 个酶活力单位(U)。
酶活回收率(%)=固定化酶总活力/加入的总酶活× 100
③酶相对活力，指在同组实验中以活性最高的为100，与其余的固定化酶或溶液酶活力之比，以百分数表示。
④酶活力的计算
1 g酶活力单位=(A/A s)×(Ws/181.19)×(13/30)×(N/W).A s:对照品溶液的吸光光度值;Ws:对照品溶液每1 mL中含酪氨酸量(g);W:供试品取样量(g);N:供试品的稀释倍数;A:供试品溶液的吸光光度值。
9.工艺流程图预测
图2 工艺路线图
10.结论
以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂制备固定化碱性蛋白酶。研究了戊二醛的浓度、给酶量、固定化温度、时间、p H 对固定碱性蛋白酶的影响。在单因素试验的基础上, 以固定化酶回收率为指标, 通过5因素5水平的分析法对壳聚糖微球固定化碱性蛋白酶工艺条件进行优化, 得到最佳固定化条件, 及在该条件下固定化碱性蛋白酶活回收率。确定最佳工艺路线图。但是如何进一步提高酶活回收率仍然还有待进一步深入研究, 实现碱性蛋白酶的定向固定化等都有待尝试。
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