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T.I.达维坚科 

固定酵素制剂的获得，需采用不同的固定矩阵和技术，依靠特定的应用程序和系统的理化特性。然而，主要任务始终是获得一个较为稳定的成分，使其具有在长期活动中的较低毒性。在建立药用应用的酶制剂，特别是来源于微生物的多糖性质的载体。这些矩阵，作为其分解后形成的单体酶解残留物是无毒的。 这些多糖许多是水溶性的，不溶性化合物可以溶解或呈现吸水膨胀。微生物多糖表现出种类繁多的化学结构，并呈现形式多样的（纤维，薄膜，颗粒，粉末，凝胶，或粘性），这使得他们方便对各种药物制剂的矩阵应用。

这项工作的目的是研究使用碱性蛋白酶，具有高活性的酶固定化微生物多糖的可能性。碱性蛋白酶快速裂解产生的粘性分泌物，在治疗炎症,加速和抗生素和磺酰胺的形成，并分解病毒和细菌毒素,都显示了良好的效果。 

实验部分 

实验方案是用1％的多糖在0.006 M磷酸缓冲液（pH值8.0）和商业从枯草芽孢杆菌（Enzim公司，乌克兰）固定化碱性蛋白酶。在一个0.1 M磷酸缓冲液（pH值8.0）（10克）每100毫升的缓冲溶液的准备中，碱性蛋白酶暂停，离心分离不溶性杂质，冷冻干燥。在实验中，固定化酶的稳定，这是众所周知的一个良好的效果，再生修复过程中需加入甘油。 

保留最初的碱性蛋白酶水解酶活性的固定化的准备工作并进行检查。按照传统方法，使用1％酪蛋白溶液作为基体蛋白水解酶活性测定。蛋白水解酶活性单位（PU/ G）是指所需要的酶量增加1.0光密度单位（OU）与酪蛋白10分钟内在37℃时，在280纳米肽的解决方案的光吸收。γ-射线辐照灭菌剂量25 kGy的固定的酶制剂。固定的酶制剂在剂量25kGyγ-射线辐照下灭菌。

酶制剂的最佳pH值及时间间隔，确定加入不同pH值（从4.0到9.0），与其他平等的活动，以酶制剂样品基板的解决方案和缓冲区。如上所述的缓冲酶解决方案的活性测定。酶制剂的最佳温度区间，在相应的缓冲溶液的本地或固定化酶的活动中，通过测量样品知温度在20至70℃。

要确定稳定的固定化的酶制剂的pH值范围，平等的活动与预设的pH值对应的缓冲区 30- 100分钟在37℃后的pH值调整在最佳水平，并保留活动进行测量。酶制剂热稳定性范围是由孵化与平等在不同的预设温度下相应的缓冲区活动的样本 在30- 100分钟后，温度调整在37℃，保留活性的测定。 

结果与讨论 

从表1看出，固定多糖凝胶（酶/载体，L：100W/ W）的碱性蛋白酶水解酶活性的数据，带或不带甘油几乎完全保留在最初的水平。 此外，还有一些活动的增加，显然，据表1的数据提出，蛋白水解酶活性，源于稳定多糖基质的行动。 甘油的稳定性表现在被25 kGy剂量的Y -射线辐照。

在广泛的酶（从1:5到1:200 W / W）/载波比的变化并没有导致蛋白水解酶活性下降，这意味着，各项准备工作的碱性蛋白酶的浓度可以是多种多样的，在相当程度上取决于其名称。 

这是建立在碱性蛋白酶的微生物多糖凝胶容易形成薄膜上的。蛋白水解酶活性下降30℃，但甘油可能会产生一定的稳定（见表2）。

随着开发新的包扎材料，用于治疗伤口,我们已经准备了纱布和无纺布含有碱性蛋白酶固定化微生物多糖的组织样本。为此，计算碱性蛋白酶的量是靠引入一种多糖凝胶基质，以获得最后的蛋白水解酶活性的绷带材料 20- 40 PU/克。然后将混合物均匀分布在纱布基板，敷料的样品后，在室温下干燥，用25 kGy的剂量的γ-射线辐照消毒。同样的程序准备与甘油（20％）的样品。测试结果表明，微生物多糖敷料几乎完全保留最初的碱性蛋白酶水解酶活性。最稳定的准备工作在与甘油添加剂的加入。

考虑多糖的碱性蛋白酶固定的筹备工作，旨在为医疗应用，我们已经研究使用消毒的可能性（表1和2）和防腐剂（2 - 溴-2 - 硝基- L-1,3 - 丙二醇，或溴硝醇）为防止微生物污染的各项准备工作。人们发现，γ导致的蛋白水解酶活性的大幅下降（初始水平的40％，请参阅表1）水凝胶的杀菌，但正如上面，甘油添加剂提供了必要的的稳定。观察碱性蛋白酶（见表2）多糖膜的灭菌，一个类似甘油稳定的行动。至于消毒纱布敷料固定的碱性蛋白酶，有人发现，最初的蛋白水解酶活性几乎完全保留。 

发展软凝胶的药用弗马斯含碱性蛋白酶（软膏成分）规定的长时间使用的酶制剂。出于这个原因，我们研究了使用溴硝醇提供的成分稳定的可能性。在化妆品中使用的溴硝醇报道 。这种防腐剂的一个特色是其抗菌活性高，尤其是聚苯乙烯，假单胞菌和其他一些革兰氏阴性菌。其他的优点是没有负面影响，自然的皮肤菌群和一个比较薄弱的抑制细胞生长的行动（例如，chlorohexin）。 

近年来，在药品生产中使用溴硝醇的可能性进行了研究，但没有考虑到使用这种防腐剂后，蛋白水解酶，包括碱性蛋白酶的行动。

溴硝醇添加碱性蛋白酶的解决方案的实验结果表明防腐剂的浓度区间（0.05 - 0.3％），蛋白水解酶活性没有显着影响。 这种间隔几乎正好与工作溴硝醇浓度（0.1 -0.3％）的时间间隔相对应。

数据显示，储存多糖凝胶固定化碱性蛋白酶，蛋白酶的活性，无溴硝醇的样品急剧下降，由微生物污染引起的贮存2周后3 - 5℃之下，样品中含有0.1％的溴硝醇展出水解酶活性没有显着下降，甚至储存1个月后。 这一结果证实在储存过程中的稳定微生物多糖凝胶防腐剂溴硝醇的显著作用。

多糖凝胶（见表3）固定在不同的温度从20到70℃的时间间隔的碱性蛋白酶水解酶活性的研究表明，固定化酶的最适温度为60℃。在加热到70℃，蛋白酶的活性下降到48 -50％，虽然γ消毒的工作，仍保留80％的活性。这一事实表明，γ射线照射,可能会产生额外交联的酶。  

多糖凝胶固定化碱性蛋白酶的热稳定性进行了测试：在3小时暴露在50℃下（表4）。根据这些实验的结果，原酶完全失活的这种待遇，而与甘油固定的准备工作，尤其是γ-辐照样品，表现出了更好的稳定性。

最佳pH值的时间间隔和稳定的固定化蛋白酶在pH值5.0样品的测定，使用1％的牛血红蛋白的解决方案。从表5中的数据可以看出，在多糖凝胶固定化碱性蛋白酶产生一个稳定的行动，这是由天然酶相比，表现为更大范围的最佳pH值的时间间隔和较高的固定化蛋白酶在酸性地区的活动。考虑到pH值5 - 6是伤口介质的典型值，我们已经研究了碱性蛋白酶多糖凝胶固定化方面在pH5.0和37℃（表6），以3小时的各项准备工作下的稳定性。这个测试的结果还表明，相比原酶,固定化蛋白酶的稳定性更高的。

因此，我们的实验结果表明，碱性蛋白酶可固定在微生物多糖上。固定化的酶制剂，值得进一步的法医生物学和药理学的调查。 

 

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