苏ICP备112451047180号-6
摘要：
对黄精根用热水提取法进行提取，之后利用乙醇沉淀、阴离子交换层析、斐林试剂络合和凝胶渗透色谱法进行分离，分离出两个中性多糖PSW-1a与PSW-1b-2。他们的结构分别采用组成和联动分析、高碘酸钾氧化、史密斯降解部分酸水解和核磁共振光谱法进行分析。PSW-1b-2 是半乳糖体的分枝，包含1，4b-D-吡喃半乳糖，1，4b-D-吡喃半乳糖的骨干与取代在每第七个的骨干残留的O-6位的b-D-吡喃半乳糖存根相连，而PSW-1a 作为高度分枝的半乳甘露聚糖，拥有1，4b-D-吡喃甘露糖骨干连接到第九位甘露糖苷残留的O-6的1b-D-吡喃半乳糖。
1．简介
黄精是一种广泛应用于中国、韩国和日本的民间药材。黄精隶属于百合科植物，主要分布在中国的东北地区。在中国传统医学中，使用的是其经过加工后干燥的根或茎。黄精的同一属植物滇黄精，多花黄精，也常被用作黄精的替代品。在传统中国医学中，黄精主要用于治疗咳嗽、头晕和肺病。药理研究表明，黄精可以刺激免疫系统，降低血糖和血脂水平，防止衰老。已报告的黄精的化学成分包括类固醇、皂苷、黄酮类化合物、生物碱、木质素、氨基酸和碳水化合物。
黄精主要活性成分应该是黄精多糖，据报道，黄精多糖是具有免疫调节、抗衰老和抗病毒的药物。在对黄精多糖生物活性的研究中，我们分别采用热水提取、碱提取得到六种同类糖和两种多糖。在本文中我们进行分离及结构研究的是黄精中首先被发现的PSW-1b-2和PSW-1a。
2.实验
2.1材料
从本地市场购买的黄精用100℃水蒸气处理，进行干燥后剪成4cm2×3 mm厚小片、从苯基蒽标样获得的单糖标准物、从惠特曼有限责任公司S-300购买的DEAE-纤维素52、从阿默舍姆生物科学院得到的葡聚糖凝胶G-75和G-150、从生物Rad有限公司购买的生物凝胶P2、从中美生物技术公司购买的Membra-CEL透析袋。
除非另有说明，其他所有化学品都是试剂级的。
2.2一般方法
45℃时，在低压下，进行了所有蒸发操作，用WZZ-1S旋光仪（上海物理光学仪器有限公司）记录旋光度，
2.3分离和纯化多糖
若想要去除脂质，在室温下，取黄精干药材3公斤，在95%乙醇中浸泡1周并进行间歇搅拌，提取过程重复三次。将残留物风干，得残留物2.25公斤。并用热水提取五次，每次4小时。将提取液收集起来，再进行透析。之后将透析液收集起来，进行离心分离，离心后的上清液添加3倍95%的乙醇。而沉淀用无水乙醇和丙酮洗净，然后在真空中干燥，就可以产生可用水提取的粗多糖PSW133g。将粗多糖放入10升1MNaOH中，在4℃下提取3小时。提取两次。将提取物用2M的HCl中和至中性，再透析。将透析后的上清液进行回流，以除去不溶物，之后将上清液收集，再用4倍95%乙醇进行沉淀。再将沉淀用无水乙醇和丙酮脱水后，再将沉淀进行真空干燥，再用碱提取得粗多糖PSB6.5g。
若想要去除已被污染的蛋白质，在4℃下40gPSW中加入适量15%(w/v)三氯乙酸(TCA)，放置2h。离心后，4℃下将上清液用10%NaOH(w/v)进行中和，然后用水进行透析。将透析后的溶液冻干，可以得到PSW 33g。取PSW 20.5g溶解在200毫升蒸馏水中，再用DEAE-纤维素(Cl¯,80cm×6 cm)进行洗脱，其中洗脱剂逐步用水，0.2M、0.5M、0.8M氯化钠和0.1M氢氧化钠，最终各得到PSW1(7.24g，35.3%的PSW)，PSW-2(4.51g,22.0%)，PSW-3(5.09g,24.8%),，PSW-4(1.73g,8.4%)，PSW-5(0.44g,2.1%)。
取PSW-10.35g溶解在35毫升水中,再添加斐林试剂，混合搅拌4小时后，进行离心。上清液用25%(w/v)醋酸溶液调节pH值为7.0，再透析。将透析液收集起来，用3倍乙醇进行沉淀，得到PSW-1b210毫克。在0℃下沉淀中加入5%醋酸乙醇(v/v)放置1分钟，再筛选。将沉淀用乙醇和丙酮进行脱水、真空烘干，得到PSW-1a52毫克。用葡聚糖凝胶G-75柱(2.6厘米×90厘米)对PSW1b进行纯化，其中蒸馏水作为洗脱剂，得到PSW-1b-2。PSW-1a不溶于水。用葡聚糖凝胶G-75柱层析来评价其同质性，在此过程中用0.5MNaOH为溶剂，用苯酚-硫酸法检测到了PSW-1a。PSW-2、PSW-3、PSW-4和PSW-5。用葡聚糖凝胶S-300进行分离，分别得到PSW-2A-1、PSW-3A、PSW-4A，PSW-5B。用葡聚糖凝胶G-150柱色谱反复纯化PSB-1和PSB-2，0.2MNaCl作为洗脱剂，得到PSB-1B和PSB-2A。各组分由苯酚-硫酸法进行监测。
2.4糖基分析
取多糖2毫克，加入2毫升2M 三氟乙酸(TFA)，在110℃下水解1.5 小时.再加入甲醇，随着压力降低，三氟乙酸被蒸发而除去。再将多糖转换成相应的糖醇醋酸酯后，通过薄层色谱法或气液色谱法对水解产物进行分析。酸性多糖的另一部分与NaBH4作用，羧基减少,然后水解，用上文所述的气液色谱法分析。将标准物和羧基减少多糖的实验结果比较，对糖成分进行定量。
2.5.甲基化分析
取真空干燥的多糖5毫克，在二甲基亚砜//碳水化合物中加入甲基碘化物和粉状氢氧化钠，进行三次甲基化。甲基化的完整性确认了IR（改性）羟基吸收的失踪。部分甲基化糖醇乙酸酯用气相色谱-质谱法分析。
2.6.高碘酸盐氧化
取25 毫克多糖溶解在20毫升0.015M NaIO4中，并在4℃下黑暗保存。每日用分光光度法在223 nm处对反应程度进行监测。72小时后，用0.1毫升乙二醇将过多的NaIO4分解。根据吸光(223nm)的减少计算NaIO4的消耗，用0.01N氢氧化钠滴定法测定反应过程中产生的甲酸。反应混合物用蒸馏水透析，透析产物与NaIO4共置一夜而减少。再经中和到中性并透析后，将透析产物冻干，经分析为糖成分。
2.7.13C和1H NMR谱
取45毫克的多糖样品溶解于0.5毫升D2O（99.8%d)，冻干后再溶解于0.5毫升D2O。在室温下，用ϕ5毫米核磁共振管、《金融时报》模式下双探头的布鲁克AM400核磁共振谱仪13C核磁共振(100 MHz)、1h核磁共振(400 MHz)测定多糖样品。所有的化学位移均是相对于四甲基硅烷而做出的，用丙酮作13C NMR 内部参考，HDO (δ4.85 ppm)为1H NMR内部参考(d31.50 ppm)。DEPT实验是使用135°极化转移脉冲进行的。
3.结果和讨论
将3Kg黄精分别用热水提取和碱提取，获得PSW两个粗多糖PSW(133 g，4.4%的原油药物质量)和PSB(6.5 g，0.2%的原油药物质量)。热水提取比碱提取的提取率要高很多。PSW包含24.6%(w/w)蛋白，因此它要用15%(w/v) TCA在4℃下处理2 h来除去蛋白质。结果表明：经TCA处理后获得的PSW'仍然含有少量蛋白质。此外PSW'显示轻微但能显著降低鼠李糖、阿拉伯糖的含量。这表明在低温和短时间条件下，15%TCA能导致这些酸的活性残留物部分清除。
由阴离子交换层析和凝胶渗透色谱法获得的多糖组分，通过测定他们的同质性，在高效凝胶渗透色谱中，对如图所示的对称峰分析其分子量，比旋光度，表 1中给出糖成分、糖醛酸、蛋白质含量及分析结果。
水洗脱得到的组分PSW-1，是主要由甘露糖和半乳糖以1.0:4.4的比例组成，这不同于高半乳糖含量的甘露聚糖，这表明PSW-1可能是半乳聚糖和甘露聚糖的混合物。因此，加入斐林试剂，通过络合铜选择性沉淀甘露聚糖。以这种方式把PSW-1分离，结果是PSW-1a进入沉淀，PSW-1b-2进入上清液。经过单糖分析和糖醛酸测定，表明PSW-1a和PSW-1b-2是两个中性多糖。PSW 1a作为其他 (1→4)-b-D-甘露聚糖，难溶于水。似乎PSW-1a和PSW-1b-2联合能显著提高其水溶性。经常有报道，(1→4)-b-D-甘露聚糖或甘露含有乙酰基。然而在强碱条件下，用斐林试剂进行络合，这可能导致脱乙酰反应，从而改变溶解度。PSW-1a或 PSW-1b-2 在本次试验中是否乙酰化却不为所知。所有酸性多糖，可用不同浓度的NaCl和0.1M NaOH洗脱，除了PSW-5B，均有高含量的半乳糖并缺乏葡萄糖，这可能是黄精多糖的特点。
根据糖基组成，PSW-1a的糖基为半乳甘露聚糖，PSW-1b-2的糖基为同半乳聚糖。PSW-2A-1和PSW-3A-1的糖基为果胶多糖。经高NaCl浓度洗脱得到的PSW-4A和PSW-5B，它们的蛋白质含量很高，这表明共析物有蛋白与多糖或多糖-蛋白性质。与此相反，两个碱可萃取组分PSB-1B和PSB-2A表现出糖成分不同的性质，PSB-2A的糖基是异木聚糖，PSB-1B是中性杂多糖。本文只对PSW 1a和PSW-1b-2进行结构研究。
3.1. PSW-1b-2结构研究
高效凝胶渗透色谱表明 PSW-1b-2 是一个同质组分。作为糖醇乙酸酯，经气液色谱法研究发现，它只含有半乳糖。红外光谱和 m-羟基二苯方法表明其缺乏糖醛酸，所以 PSW-1b-2 是中性的同半乳聚糖。在 889.0cm吸收暗示b 端为半乳糖残基。甲基化分析表明，多糖由1，4-，1,4,6 链接和终端半乳糖残留以1.1:5.7:1.0的比例组成，这也表明 1，4-链接分枝吡喃半乳糖所占的比率。
Table 1
The molecular weight, specific rotation, and chemical composition of thepolysaccharides isolated from Polygonatumsibiricum.
| Fractions | PSW | PSW’ | PSW-1a | PSW-1b-2 | PSW-2A-1 | PSW-3A-1 | PSW-4A | PSW-5B | PSB | PPSN-1B | PSB-2A |
|
MW(kd) [α]D Carbohydr.(w%) Protain.(w%) UA.(w%) Glycosy composition.(mol%) Rhamnose Arabinose Xylose Mannose Galactose Glucose Galacturonic acid Glucuronic acid |
na na 66.5 24.6 10.2 7.1 6.3 2.8 10.3 60.3 2.3 na na |
na na 78.0 11.6 13.6 4.5 4.8 2.9 10.9 60.5 2.9 na na |
na na 100 一 一 一 一 一 88.8 11.2 一 一 一 |
42 +61..0 100 一 一 一 一 一 一 100 一 一 一 |
360 +30.9 70.5 一 19.6 20.2 11.9 一 一 51.2 一 16.7 一 |
200 +92.0 50.1 17.0 31.6 29.2 10.4 一 一 20.8 一 39.6 一 |
320 +237.6 32.1 45.9 22.5 19.6 27.5 一 一 37.3 一 15.7 一 |
180 +195.9 34.4 71.4 11.6 12.3 18.5 一 一 42.0 16.0 11.1 一 |
na na 58.7 28.8 10.6 一 15.9 57.1 一 20.8 6.2 na na |
17 +54.0 91.6 一 一 一 一 17.1 一 69.7 13.2 一 一 |
·16 -11.6 80.2 一 17.3 一 16.1 71.0 一 一 一 一 12.9 |
对PSW-1b-2按顺序进行两个高碘酸钾氧化程序，以实现完全氧化。在第一氧化过程(72h)中，加入1mol的半乳糖残基，消耗NaIO40.84mol，产生0.12mol的甲酸。基于甲基化分析，这与计算值（消耗1.14molNaIO4，产生0.14mol甲酸）相比，NaIO4消耗率显著低于预期值。这可能是因为源于间残留半醇形成的醛与邻羟基链接1,4半乳糖残基的不完全氧化。
作为糖醇乙酸酯的聚羟基衍生物经气液色谱法分析表明，其存在半乳糖且一些半乳糖残基有抗氧化功能。将该类衍生物用NaIO4进一步氧化，处理方式和产品相同。气液色谱法分析表明，新衍生物包含赤藓糖醇、甘油，他们的比例是4.6:1，而没有检测到半乳糖，说明其完全氧化。
PSW-1b-2用13C核磁共振氢谱法分析，谱图中，在异区域(图1)显示两类信号，分别在d107.4和106.6 ppm，表明所有半乳糖残基均有b端。信号强组对应于1,4和1,4,6链接的残留物，较弱的信号组对应于终端的残留物(表2)。在DEPT谱d73.50 ppm的微弱信号和反向峰可归因于取代C-6 1,4,6链接的残留物。交叉峰对应于异核多键相关谱中的H-1(d4.48 ppm) 和C4 (d80.72 ppm)的1，4-链接半乳糖(图2)，这表明H-1的骨干半乳糖和其相邻的1，4-半乳糖残基在一起的C4的长程相关性。以上研究表明PSW-1b-2具b-(1→4)-链接骨干结构。半乳糖终端的C1 (d106.65 ppm) 与1,4,6-链接半乳糖的C6(d3.45 ppm)呈负相关，这表明半乳糖终端直接附加到O-6分支的残留上，正如已被证实了的H-1(d4.28 ppm) 半乳糖终端和 1,4,6 连接的半乳糖 C-6 (d73.50 ppm) 的相关性。
Table 2
Assignment of13C NMR signals for PSW-1b-2
| Residues | C-1 | C-2 | C-3 | C-4 | C-5 | C-6 |
|
b-Galp(1à à4)Galp(1à |
106.56 107.42 |
73.80 74.88 |
75.77 76.36 |
71.10 80.72 |
78.48 77.57 |
64.05 63.80 |
| à4,6)Galp (1à | 107.42 | 74.88 | 76.36 | 80.72 | 77.57 | 73.5 |
人们对黄精属植物多糖组分进行了广泛的研究，分离出并被确认了由不同比例的甘露聚醣/葡萄糖和葡糖果聚糖组成的葡甘聚糖。在本文中，我们分离并确认了两个中性多糖——b-D-半乳聚糖和带有分枝的半乳甘露聚糖，这两个黄精属植物的组分还没有被人们所报道过。据报道，属于相同的黄精属的各种物种含有不同多糖成分。遗传背景、生长状况或季节的收获都可能导致这种差异。将经伴刀豆球蛋白A和内毒素在体外诱导T淋巴细胞和B淋巴细胞扩散而得到的模型进行原发性免疫试验，这表明：粗多糖PSW是有效的，但PSW-1a和PSW-1b-2是不活跃的，免疫活性可能是PSW的其他多糖组分导致的。
致谢
本文部分研究由全国科学基支持。
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